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夏盛饲用植酸酶酶活的测定 [复制链接]

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离线孟子皓592
 

只看楼主 倒序阅读 使用道具 楼主  发表于: 2016-12-20

饲用植酸酶酶活的测定
1.原理
    植酸酶在一定温度和pH条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性溶液中,用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3 •16MoO3]复合物,在波长415 nm下进行比色测定。


2.植酸酶活性单位的定义
样品在植酸钠浓度为5.0mmol/l、温度37℃、pH值5.5的条件下,每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以U表示。
3.仪器和设备



4.试剂
本标准所用试剂和水在无注明其它要求时,均指分析纯和GB/T6682规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。
5.试剂配制
5.1 乙酸缓冲液(I) ,c(CH3C00Na•3H2O)为0.25 mol/l
称取20.52g无水乙酸钠于1 000 ml容量瓶中,加入900 ml水溶解,用冰乙酸调节pH至5.50士0.01,并用蒸馏水定容至1000 ml,室温下存放2个月有效。
5.2 乙酸缓冲液(Ⅱ) ,c(CH3C00Na•3 H20)为0.25 mol/I
称取34.02g三水乙酸钠,0.5gTritonX-100, 0.5g牛血清蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中,加入900ml水溶解,用冰乙酸调节pH至5.00 士0.01,并用蒸馏水定容至1000ml,室温下存放2个月有效。
5.3 植酸钠溶液,c(C6H6O24P6Na12)为7.5 mmol/l
称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100 ml容量瓶中,用乙酸缓冲液(5.1)溶解并定容至刻度,现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol/l)。
5.4 硝酸溶液
1+2水溶液。
5.5 100g/1钼酸铵溶液
称取l0g钼酸铵〔(NH4)5Mo7024 . 4H20〕于100ml容量瓶中,加入l.0 ml氨水(25%)用水溶解定容至刻度。
5.6 2.35g/l钒酸铵溶液
称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100ml,棕色容量瓶中,加入2ml硝酸溶液(5.4),用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。

5.7 颜色终止液
移取2份硝酸溶液(5.4),1份钼酸铵溶液(5.5),1份钒酸铵溶液(5.6)混合后使用,现用现配。
6.试样制备
取有代表性样品,用四分法将试样缩分至200g,夏盛植酸酶产品不需粉碎,配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛,装入密封容器,防止试样成分变化。
7.测定步骤
7.1绝对法(仲裁法)

7.1.1标准曲线
准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(A.4.11)于100ml容量瓶中,用乙酸缓冲液(A.5.1)溶解,并定容至100m L,浓度为50.0 mmol/l。按表A1的比例稀释成不同浓度,与试样一起反应测定,以无机磷浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,列出直线回归方程(y=ax+b )
表Al
标准序号    稀释量/ml    浓度(mmol/l)
1
2
3
4
5    0.5→1
0.5→2
0.5→4
0.5→8
0.5→16    25
12.5
6.25
3.125
1.5625

7.1.2试样溶液的制备
按照表A2中建议的称样量称取试样两份,精确至0.0001g,置于100ml容量瓶中,加入约70 ml乙酸缓冲液(A.5.2),一个磁力棒,在磁力搅拌器上高速搅拌30 min,用乙酸缓冲液(A.5.2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀,在离心机上以4000 r/min离心10 min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(A.5.2)稀释,使样液浓度保持在0.4 U/ml左右,待反应。
注:根据样品植酸酶活性的不同,建议称样量见表A2。
表A2  建议称样量
植酸酶活性/(U/g)    称样量/g
5000    0.1~1
2500    0.2~1
500    1~2
300    1~2
1~0.5    5~10
建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样,便于检验整个操作过程是否有偏差。
7.1.3反应
取10ml试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(A.5.3)开始,向每支试管中
加入试剂的时间间隔要绝对一致,37℃水解30min。
反应步骤及试剂、溶液用量见表A3
表A3  反应步骤及试剂、溶液用量
反应顺序    样品、标准    样品空白     (标准空白)
1.加乙酸缓冲液(A.5.1)     1.8ml    1.8ml     6ml
2.加人待反应液    0.2ml    0.2ml    -
3.混合    √    √    -
4.37℃预热5min     √    —    -
5 依次加人底物(A.5.3)    4ml    4ml(第二步)    -
6.混合    √    √    -
7.37℃水解30min    √    —    -
8.依次加人终止液(A.5.7)     4ml    4ml(第一步)    4
9.混合    √    √    √
总体积    10ml    10ml    10ml
7.1.4样品测定
反应后的试样在室温下静置10imn,如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min,上清液以标准曲线的空白调零,在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A。)和样品溶液(A)的吸光值,A一A。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
7.2相对法

7.2.1标准曲线
准确称取一定量的标准植酸酶(4.10),精确至0.0001g,于50ml容量瓶中,用0.25mol/l乙酸缓冲液(5.1)溶解并定容至刻度。做两次稀释使植酸酶活性大约在0.05U/mL左右,当日配制。
将上述植酸酶标准液再按表A4比例用缓冲液(5.1)进行稀释,需要准确计算植酸酶的浓度。然后与样品一起进行反应测定。以植酸酶浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,列出直线回归方程(y=ax+b)。




表A4
标准序号    最终稀释量/ml    大约酶活力(U/ml)
0
1
2
3
4
5
6    0→5.0
1.0→5.0
1.5→5.0
2.0→5.0
2.5→5.0
3.0→5.0
3.5→5.0    0
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
7.2.2样品溶液的制备
以下操作步骤按7.2.1进行,使样液浓度保持在0.02U/ml左右。待反应
注 :添加剂预混合饲料样品需采用乙酸缓冲液(5.2)。
7.2.3反应
取10ml试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(5.3)开始,向每支试管加入试剂的时间间隔要绝对一致,37℃水解30min.
反应步骤及试剂、溶液用量见表A5。
表A5
反应顺序    样液    样液空白    标准1)
1.加人待反应液    2 ml    2ml    2ml
2. 37℃ 预热5min    √    √    √
3.依次加人底(A.5.3)    4 ml    4 ml(第2步)    4 ml
4.混合    √    √    √
5. 37℃水解30 min    √    √    √
6.依次加人终止液(A.5.7)    4 ml    4 ml(第1步)    4ml
7.混合    √    √    √
总体积    10ml    10 ml    10 m1
1) 标准空白加2ml乙酸缓冲液(A.5.1)
7.2.4样品测定
反应后的试样在室温下静置10min,如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min,上清液以标准曲线的空白调零,在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A。)和样品溶液(A)的吸光值,A-A。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
8结果计算和表示
8.1植酸酶活性U按式(1)和式(2)计算
8.1.1绝对法        
U= C/(m×30)×F                             …………………………(1)
式中:
U一试样中植酸酶的活性,U/g;
C一根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性,U;
F一试样溶液反应前的总稀释倍数;
m一试样质量,g;
30--反应时间,min.
8.1.2相对法
         U=C/m×F                          …………………………(2)
式中:
U—试样中植酸酶的活性,U/g;
C—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性,U;
F一试样溶液反应前的总稀释倍数;
m一试样质量,g。
8.2结果表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示,保留整数。
8..3 重复性
同一样品两个平行测定值的相对偏差,植酸酶产品不大于8%。添加植酸酶的各种饲料样品不大于10%。
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