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收藏 | 举报 2011-02-19 12:33   关注:3951   回答:1

Enterokinase是什么酶?

已解决 悬赏分:5 - 解决时间 2011-02-20 15:44
  支持(0)  |   反对(4)  |   举报 2011-02-20 15:31
肠激酶(Enterokinase, EK)最早由Schepovalnikow于1899年在Pavlov的实验室发现,Kunitz于1939年证实了肠激酶是胰蛋白酶原的生理激活剂。由于胰蛋白酶是消化系统其它许多酶原的激活剂,因而肠激酶被认为是消化系统重要的起始酶之一。 肠激酶是哺乳动物特有的一种丝氨酸蛋白酶,迄今为止已从人、牛、鼠、猪等纯化了天然的肠激酶,其中以牛的肠激酶理化性质研究的最为透彻。天然的牛肠激酶由一条115KD的重链(结构亚基)和一条35KD的轻链(催化亚基)以一个二硫键连接而成。其中,结构亚基把催化亚基附着在肠粘膜刷状缘上并朝向肠腔,催化亚基能特异性识别胰蛋白酶原中五肽序列(Asp)4-Lys并在其羧基端切断肽链,释放出活性胰蛋白酶。Light和Fonseca进一步证实了单独的牛肠激酶轻链仍具有全酶所具有的特异性切割活性。牛肠激酶在PH5~PH9之间、温度4℃~37℃之间均能保持其特异的切割活性,且位点特异性强、切割活性高,因而非常适合基因工程产品中融合蛋白的切割。 基因工程技术发展到今天,已经在许多环节上作了创新,其中很重要的一个方面就是在目的蛋白质产物N端连接上各种功能性肽段构建成融合蛋白,以达到提高表达水平、改变表达类型(由细胞内表达转变为分泌型表达)、改善产物的溶解性、简化产物提纯步骤等等目的。这些构思精巧的表达策略极大地推动了基因工程在生命科学领域的应用,但是,各种人为添加的肽段也产生了一些新问题,因为在很多研究中,真正需要的是没有附加片段的目的蛋白质,而额外添加的肽段(即使是很短的)往往会影响产物蛋白质的功能,干扰实验结果;更重要的是,各类用于人体治疗的基因工程药物(特别是注射用药)必须严格符合氨基酸序列的设计要求,额外增加的肽段会引起很多严重问题,例如引发人体产生抗药物抗体等等。因此,能否有效而完整地把上述各种融合肽段切除并再生出目的蛋白质就成为各种创新表达策略最终取得成功的关键。 于是,高度特异性的牛肠激酶就成为解决上述问题的首选工具,牛肠激酶的活性中心有一个独特的阳离子位点,可以和带强负电的(Asp)4相互作用而促使酶与底物的结合。几乎所有物种的胰蛋白酶原都含有这样的(Asp)4四肽序列,而(Asp)4-Lys序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见,因此,牛肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性,这种特点使其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具。研究者们在融合蛋白的功能性肽段与目的产物之间设计了一个牛肠激酶的作用位点序列,表达后的融合蛋白再经过牛肠激酶作用,就除去了功能性肽段,而其罕见的作用位点序列避免了目的蛋白质产物被酶切降解的可能性,最终再生获得了符合要求的目的产物。虽然世界各地的研究机构和生产厂家也有使用其他蛋白酶作为再生工具的,但百分之九十以上的使用者选用牛肠激酶。 目前,全世界每年发表的与牛肠激酶这个用途有关的文献很多,可谓不胜枚举。在此,我们只举几个近年来比较典型的例子来具体说明一下其实际应用。 A)1999年,美国农业生物技术中心(马里兰州)构建了新型的杆状病毒表达载体,这种载体在依次添加了一段6组氨酸亲和配体序列、绿荧光蛋白(GFP)序列以及牛肠激酶作用位点序列。用此表达载体生产人白介素-2(hIL-2)以及氯霉素乙酰转移酶(CAT),在幼虫体内都获得了高效表达。令人瞩目的是,此项载体N端修饰技术是一次对昆虫表达系统的革新并使其将很快普及成为被广泛应用的新一代表达宿主。因为使用了GFP作为荧光标记,能清楚地确定转染过程、收获时间以及蛋白质产量,还省去了表达、分离和纯化过程中做免疫印染(Western Blot)的繁琐步骤,并且提纯产品时可以快速鉴定洗脱液和流穿液中产物蛋白质的含量。根据荧光强度与目的蛋白质(hIL-2以及CAT)含量成线性正比的关系,筛选到最高表达水平的幼虫(比平均水平高3倍)。因GFP和目的产物共存于融合蛋白上故能直接筛选表达宿主,使得转染和表达生产成为一个连续过程,改变了目前批过程的状况。最后,利用N端另一个功能肽段--6组氨酸亲和配体,以金属离子亲和层析法提纯此融合蛋白后,用牛肠激酶切除N端附加的功能汰,就再生了目的产物。 这家研究中心已计划对这项技术进行商品化开发。 B)1999年,韩国生物科学与技术研究所构建了一个新型的大肠杆菌表达载体,在目的蛋白质的N端依次添加了以下的肽段:来源于酿酒酵母的羧肽酶Y(CPY)前肽、6组氨酸亲和配体、牛肠激酶作用位点序列。CPY前肽能提高短肽产物在大肠杆菌中的表达效率,而6组氨酸亲和配体与金属离子亲和层析柱的高效结合极大地简化融合蛋白的纯化步骤。用此载体成功地高效表达了一些有临床价值的蛋白质激素,如人甲状旁腺激素片断、人胰高血糖素等等。融合蛋白经牛肠激酶作用后用反向HPLC分析,显示再生的目的产物与天然蛋白完全相同。 C)1998年,同是这家韩国研究所构建了高效表达人生长激素的新型大肠杆菌表达载体,在生长激素的N端依次添加了以下肽段:人a肿瘤坏死因子(hTNF-a)N端的五肽序列,6组氨酸亲和配体、牛肠激酶作用位点序列。其中hTNF-aN端的五肽片段极大地提高了生长激素的表达水平。这个高效表达载体的构建成功,使得这个研究所的人生长激素项目进入了规模生产的阶段。 D)1995年,挪威Bergen大学构建了表达人苯丙氨酸羟化酶(hPAH)的新型大肠杆菌表达载体,在目的蛋白hPAH的N端依次加上了大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)以及牛肠激酶作用位点序列。hPAH在普通载体pET内表达后非常容易被宿主细胞的蛋白酶降解,纯化产量很低。而用新型载体以融合蛋白的形式表达后,hPAH就能抵抗宿主细胞蛋白酶的降解作用,并且可以用直链淀粉树脂亲和层析法极为简便地提纯。经牛肠激酶作用并经过离子交换(DEAE)层析,获得了高产量、高纯度的再生hPAH,其催化活性和理化性质与来源于人体肝脏的天然hPAH完全相同。 最为重要的是:美国FDA于1997年批准的基因工程新药—重组人白介素11,就是采用融合蛋白表达,再利用肠激酶切割获得重组人白介素11单体。国内已有多家研究机构开发的重组人白介素11也是采用这一技术路线。 从动物体内纯化天然肠激酶成本高,同时易混入其它蛋白酶,是其大规模应用的限制因素。采用基因工程方法可有望解决这一问题。
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