推广 热搜: 酶制剂  氧化酶  淀粉酶  蛋白酶  生物酶  蛋白  纤维素酶  纯化  转氨酶  饲料 

β-甘露聚糖酶的基因工程技术研究

   日期:2011-01-27     来源:www.cnenzyme.com    作者:酶网    
核心提示:

β-甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究的热点之一,也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一(Hashem等,2001;Kurakake等;2001;Parker等,2001)。β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC 3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶,以内切方式降解β-1,4糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖,其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。β-甘露聚糖酶的来源非常广泛,包括植物、细菌、真菌、放

β-甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究的热点之一,也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一(Hashem等,2001;Kurakake等;2001;Parker等,2001)。β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC 3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶,以内切方式降解β-1,4糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖,其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。β-甘露聚糖酶的来源非常广泛,包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物(Hashem等,2001;Kurakake等;2001;Parker等,2001;陈小兵等,2004,2005)。甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外,分布最广泛、含量最高的一类半纤维素,而且在许多植物中有如淀粉样的大量积累(Chesson,1987;李欣等;1980)。畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶,对这类物质的转化需要添加外源酶。饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足,消除和降解饲料原料中的抗营养因子,促进畜禽生长,减少养殖污染。甘露聚糖类物质用酶处理,也可生产高品质的甘露寡糖产品。

1 β-甘露聚糖酶菌种选育

国内自20世纪80年代开展微生物甘露聚糖酶发酵生产技术研究,进展很快。1980年我国李欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。1985年以后,随着β-甘露聚糖酶和甘露寡糖应用领域的开发,新菌种筛选和诱导育种等相关研究竞争显著加剧。如杨文博等(1995)研究了产β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件。崔福绵等(1999)研究了枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生及性质,选育菌种的酶产量达到120 U/ml。我国另一具有特色的工作是分泌β-甘露聚糖酶的分离选育。如中国科学院微生物研究所马延和等(1991)较早提出利用极端微生物菌种分泌的碱性β-甘露聚糖酶生产甘露寡糖的方法。利用嗜碱芽孢杆菌N16-5以魔芋粉为原料,发酵生产β-甘露聚糖酶,发酵液的酶活力达到500 U/ml,甘露寡糖后提取收率80%以上。

丁宏标等从1995年开始饲用酶菌种筛选工作,分离得到一株能分泌酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉。其分泌的β-甘露聚糖酶,工作温度30~85℃,最适反应温度70℃,反应pH 2~9.2,最适pH 3.0~5.8;摇瓶条件下酶活力达到150 U/ml,符合饲料用酶条件。该菌种、发酵工艺、及甘露寡糖和酶的应用方法已申请中国发明专利。

2 甘露聚糖酶的工业生产和基因工程的研究进展

国内外对β-甘露聚糖酶、甘露寡糖生产方法的研究涉及酶的生产、纯化与特性研究、基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。生产技术方面的标志性进展有:1987年日本理化研究所对芽孢杆菌AM-001的β-甘露聚糖酶,通过多种方法选育,酶活力由36 U/ml提高到了430 U/ml。1995年,美国ChemGen公司研制了一种β-甘露聚糖酶,其菌种Bacillus lentus 的产酶能力达400 U/ml,随后开发用做饲料添加剂,是目前美国销量最大的饲料用酶(美国专利号96107126.5)。

β-甘露聚糖酶基因工程方面的研究已有成功报道。有一些β-甘露聚糖酶被克隆,并在大肠杆菌中表达,如Mendoza等(1995)将克隆自Bacillus subtilis NM-39的β-甘露聚糖酶基因转入大肠杆菌DH5a表达,重组酶活力为4.9 U/ml。还有其它微生物来源的基因,如嗜碱芽孢杆菌(Alkalophilic Bacillus sp.)AM-001、极端嗜热厌氧菌、荧光假单孢菌、变青链霉菌以及里氏木霉等,在大肠杆菌中表达成功。大多数β-甘露聚糖酶除了有催化功能域,同时具有纤维素结合域(cellulose binding domain,CBD),因此属于纤维素-半纤维素双功能基因家族。由于植物纤维素与半纤维素总是相伴存在,CBD有利于酶更好的结合靶物质,也有利于破坏植物聚糖的晶体结构,促进水解(Hagglund等,2003)。

用大肠杆菌表达主要证明酶基因的活性功能,人们也在进行β-甘露聚糖酶基因在酵母中的表达。由于在酵母系统中表达的蛋白在糖基化、磷酸化等方面的优越性远高于在大肠杆菌中表达,所以这些工作更有吸引力。Stalbrand等(1995)利用从Trichoderma reesei克隆的β-甘露葡聚糖酶基因在酿酒酵母中实现了重组表达。Tang等(2001)用毕赤酵母表达来源于Agaricus bisporus strain C54-carb8的甘露聚糖酶基因cel4,表达量提高了3倍。现在NCBI的Genebank和EMBL基因库中已列入近百种不同来源的β-甘露聚糖酶基因。不同来源的β-甘露聚糖酶基因分别在原核表达系统和真核表达系统中进行了表达,其中对于在大肠杆菌表达系统表达的β-甘露聚糖酶,活力最高的酶基因来源于一株芽孢杆菌,酶活力可达41.8 U/ml(谭秀华等,2005)。在酵母表达系统表达的β-甘露聚糖酶活力最高的酶基因来源于一种海洋软体动物(Mytilus edulis)的甘露聚糖酶基因,在14L的发酵罐中表达量达到900 mg/l,酶的比活力为45.6U/mg(Xu等,2002)。总体来说,酶的表达量偏低,达不到工业生产的要求。

近年来我们一直致力于β-甘露聚糖酶的资源开发,自1995年分离得到一株能分泌酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉后,利用生物技术不断构建产β-甘露聚糖酶的基因工程菌株。我们从一株产β-甘露聚糖酶的芽孢杆菌克隆到β-甘露聚糖酶基因,将其插入到巴斯得毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得了重组表达载体pMAN22,转化巴斯德毕赤酵母,筛选得到了高效分泌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌MAN22。在5l发酵罐发酵酶活力可达110,0000U/ml,是迄今报道酶活力最高的。目前已经完成小试,正在进行进一步的发酵优化试验。发酵酶液用载体颗粒吸附所制成产品的酶活力是和美酵素的7倍。MAN22所产甘露聚糖酶的活力明显高于目前国内外相关报道,达到国际领先水平,并且该酶的一些性质也适宜在动物的胃肠发挥作用,动物实验同时表明该酶具有良好的饲喂效果,具有工业化生产的巨大潜力。

3 β-甘露聚糖酶的应用

甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分,广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分,在其他植物性饲料原料中含量也很高,如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7%,11.9%,19.6%和33.7%,在一些植物胶、椰子、莴苣、合欢、魔芋以及针叶树中也都含有丰富的甘露聚糖和异甘露聚糖(Chesson,1987;李欣等,1980)。这使得β-甘露聚糖酶的开发和利用具有重要的意义。

由于畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶,因此甘露聚糖类物质是一种主要的抗营养因子。微生物来源的β-甘露聚糖酶能以内切方式降解β-1,4糖苷键,其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等,降解产物为甘露寡糖和甘露糖。已广泛证实β-甘露聚糖酶对动物的生长发育具有一系列积极作用。包括:1)促进动物生长,提高动物的饲料转化效率。β-甘露聚糖酶可提高肉鸡增重4.4%~10.3%,饲料转化率2.9%~6.0%,提高肉猪增重4.2%~8.6%,饲料转化率4%~9%(Chesson,1987;Nelson等,1996;Jackson等,1999;Pettey等,2002;Jackson等,2003;Lee等,2003;Daskiran等,2004);2) 甘露聚糖酶可以促进养分消化,改善动物肠道微生物生态,改善动物体的健康状况。玉米-豆粕日粮中添加0.1%甘露聚糖酶可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12%(Jackson等,2004);3) 甘露聚糖酶可以降低肠道内容物的粘稠度,减少粪便排泄,减轻环境污染(Chesson,1987;Jackson等,1999;Pettey等;2002;Jackson等,2003);4) β-甘露聚糖酶可以提高微量元素的生物利用率。甘露聚糖吸附微量元素,抑制其消化吸收(Chesson,1987;Jackson等,1999;Jackson等,2003);5) β-甘露聚糖酶降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长;6) β-甘露聚糖酶及降解产物甘露寡糖可正向刺激机体免疫活性;7)降解产物甘露寡糖还能够吸附真菌毒素,减少抗生素等化学药物的使用,是生产绿色动物食品的添加剂。

我国猪鸡的主要日粮是玉米-豆粕型日粮,其主要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。玉米和豆粕中甘露聚糖占非淀粉多糖的比例分别为11.7%和22.7%。大豆多糖可吸收自身重量七倍的水,并吸附多种微量元素,降低其生物利用率。β-甘露聚糖酶是对玉米-豆粕型日粮非常有效的饲用酶制剂,它可以降解其含有的抗消化粘性多糖,促生长提高饲料利用效率的效果非常显著(表1)(Chesson,1987;Pettey等,2002;Jackson等,2003;Lee等,2003;Daskiran等,2004;Jackson等,2004)。

表1 β-甘露聚糖酶对玉米-豆粕型日粮的应用效果

动物种类

增重,%

饲料转化效率,%

+4.2~18

+4~9

火鸡

+5

+3.7~6

肉鸡

+2.2~3.6

+4.3~5.6

美国ChemGen公司开发的β-甘露聚糖酶产品Hemicell®是国际市场上应用最广泛的饲用酶制剂之一,也是目前世界上用于玉米-豆粕型日粮的销售量最大的酶制剂,其在中国的商品名是和美酵素。目前有关β-甘露聚糖酶的应用研究主要集中在北美和欧洲进行,大多是关于美国ChemGen公司生产的β-甘露聚糖酶,结果显示其在玉米-豆粕型日粮中效果显著。

酶法分解制备甘露寡糖,是β-甘露聚糖酶应用研究的重点内容之一。但一些β-甘露聚糖酶专业性不强,转化率不太高。目前相当一些甘露寡糖产品是啤酒酵母提取物,如美国奥特奇公司销售的此种产品,寡糖含量为65%。目前我们正在分离高效的β-甘露聚糖酶基因,酶解魔芋甘露聚糖、田箐胶等制备甘露寡糖,希望较大幅度降低生产成本。同时利用基因工程技术制备高活性β-甘露聚糖酶,提高酶的产量,进一步降低成本,推进甘露聚糖酶和甘露寡糖在饲料中的应用。

4 展望

β-甘露聚糖酶和甘露寡糖的推广应用,符合生态养殖业的需要。它们还可广泛应用于食品、纺织、石油等工业领域,如甘露寡糖是最有效的双岐因子之一,可以口服,国内外已经广泛地用于保健食品中。β-甘露聚糖酶还可用于从豆类植物中提炼植物油,降低咖啡、巧克力、可可液的粘性。β-甘露聚糖酶和木聚糖酶协同作用可用于造纸工业。β-甘露聚糖酶还可作为石油压裂液的破胶剂,具有效力高、成本低、对地层伤害小等优点。特别是利用该酶来水解魔芋以制备高纯度的甘露寡糖,其市场前景十分广阔。作为生产原料的魔芋广泛分布于四川、云南、贵州、湖北西部等欠发达的地区,该酶的大规模生产对于科技扶贫也有着重要的推动作用。因而,近年来β-甘露聚糖酶的研究逐渐成为了国内外的研究热点。但是国内各有关科研单位的研究大多限于实验室阶段,所报道的发酵酶活低,酶解产物组成不稳定,生产成本较高,难以取得竞争优势。筛选高比活酶基因,应用基因工程技术构建高效产酶的微生物,进行分子育种改良酶的性质,优化寡糖的酶解制备工艺,是国际上的研究热点和方向,也具有很好的科学意义和应用前景。

 
标签: [标签:关健字]
 
更多>同类技术资料

推荐图文
推荐技术资料
点击排行
网站首页  |  付款方式  |  联系方式  |  文献服务  |  服务条款  |  关于我们  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  鄂ICP备06014995号-4