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一种阴离子型层状材料固定化酶及其制备方法，这种固定化酶是将酶分子通过插入类水滑石层板之间的客体分子和交联剂，被固定在类水滑石层板之间。其制备方法是将含有羧基和氨基基团，且羧基数量大于等于氨基数量的客体分子通过插层方法组装进入阴离子型层状材料-类水滑石层板之间，再加入交联剂和酶，在交联剂作用下客体分子上的氨基基团与酶分子上的氨基基团形成共价键，酶分子被固定于水滑石层间得到固定化酶层柱材料。该固定化酶因受层板内几何结构的限制，反应时底物和产物在由层柱材料构筑的反应平台上进行有序转换，而酶分子不会流失，且具有较好的稳定性。