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本发明提供一种固定化胆碱酯酶片的制备方法，包括：(1)、载体处理：将载体制成直径5-15mm的圆片，置于磷酸盐缓冲溶液中活化，备用；(2)、固定化：在冰浴4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸盐缓冲溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白混合，加入预处理的载体，于3-5℃保温2-12小时；(3)、洗涤及保存：取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液冲洗数次，最后将酶片浸泡在磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中3-5℃保存。本发明制备的酶片重现性好，活性高、寿命长；酶片保存方法只需浸泡在溶液中，操作简便，使酶片的商品化生产成为可能。