魏喜换‘，王春娟‘，赵梅‘，李剑芳‘，邻敏辰乙‘
(1江南大学食品学院，江苏无锡214122;0江南大学无锡医学院，江苏无锡214122)
摘要以宇佐美曲霉(Aspergillus usa}二;)YL-O 1-78的5家族份甘露聚糖酶(八nMami八)为研究对象，对其底物录
和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数K },值较低的突变酶八、iMami八viiir.首先采用同源建模
和分子对接模拟等方法预测八nMami八与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMo!软件统计到距
甘露二糖8人以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与八nMami八一级结构序列全同率大于50%的份甘露
聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点，依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置，选
择八nMan,i八中的Tyr"' , Phc``〔和Tyr''"作为拟突变氨基酸，将它们分别替换为性质相似的或在其他份甘露聚糖
酶序列中出现频率高的氨基酸，形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBS八法计算八nMan,i八及其拟突变酶与甘
露二糖的结合自由能(4(ii>}},a )，其中八、iMami八viiir的△G!川.为一237. 7 kJ/mol，较其他酶的△U i>}}.均低.基于该理性
设计采用大引物PC'R技术将八、iMami八基因(AunaanSA)中编码(hyr"’的密码子"h八C'突变为编码Phc"’的TTC,
构建出突变酶基因(AumamSA Y"'F ).分别将AunaanSAY""和AunaanSA在毕赤酵母(}Sll;i中进行表达，并对重组
表达产物rc八nMan,i八viiir和rc八nMami八进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:rc八nMan,i八viiir对瓜尔豆胶
的K },值由突变前的3.9 mg/mI降低为2 . ;i mg/mI;而突变前后酶的V值变化不大.该研究运用多种生物信息
学软件对提高八nMami八底物录和力进行了理性设计，并通过定点突变证实2，这为汗甘露聚糖酶乃至其他各种酶
底物录和力的定向改造提供了新的技术策略.
关键词份 甘露聚糖酶;底物录和力;定向改造;理性设计;定点突变
中图分类号Q556}.2文献标志码八
