（4）肠激酶酶切
酵母表达的重组牛肠激酶，酶切用量每16mg融合蛋白用肠激酶1个单位，酶切体系为pH8.0，20mM PB，酶切温度35-37℃，酶切时间16小时。
点评：商品化的肠激酶有多种，有生化提取的，有重组大肠杆菌的，还有就是重组酵母表达的，其中以重组酵母表达的肠激酶活性最高。
此处的肠激酶活性单位为Invitrogen公司产品标准，定义可以参考Invitrogen公司的EKMax manual，不过Invitrogen公司的推荐参考量太低了，它的标准是1个单位20ug融合蛋白，哈哈。
Invitrogen公司的标准酶切体系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, and 0.1% Tween-20。本例中没有加CaCl2和Tween-20，试验表明无明显影响。如果你的融合蛋白不好切，可以考虑增加这两项。
此处的酶切用量标准由酶切梯度试验获得。即固定融合蛋白量，加入不同单位的肠激酶，SDS-PAGE比较酶切效果。取融合蛋白酶切约80-90%的量。可能有人会问，为什么不是95-100%？做过酶切梯度的就会知道，这个10%量的增加是以酶量成几倍增加才能实现，而且酶量越大，非特异性切割的可能性就越大。
酶切时间取16小时是因为下班前加好酶，第二天上班时正好是16个小时，符合我等工作节奏哦。
酶切可置于恒温摇床上进行，转速开得缓慢点。小量酶切就放在恒温培养箱中。
（5）Q Sepharose FF柱纯化
pH8.0，20mM PB平衡Q柱，上样酶切后样品，目标蛋白穿透，未酶切的融合蛋白和Trx-histag吸附于柱上。
点评：此步纯化很简单，仅仅是个流穿纯化，但效果非常好。Q柱不仅去除了绝大部分的杂蛋白，而且还去除了内毒素和酶切时加入的肠激酶。
Q柱在平衡前要用0.5N的NaOH洗柱以去除内毒素，平衡缓冲液要用注射用水配制且通过3kd的超滤膜来去除缓冲液中的内毒素。
样品在上Q柱前，要进行过滤操作。酶切过程中会有少量的沉淀产生，可能是因为我没有往酶切体系中加0.1% Tween-20。药用蛋白不敢随便加表面活性剂，否则要在QC中验证工艺可以完全去除。酶切加入的肠激酶就必须做去除的QC验证，这是后话了。
Q/DEAE类型的阴离子交换柱是纯化中应用最广泛的操作。因为大部分蛋白质的等电点在中性或偏酸性，阴离子交换柱可以吸附纯化。换而言之，如果你的目标蛋白等电点比较高，那么恭喜你了，纯化要方便多了。还不明白？你的目标蛋白与众不同啊，就像本例中的蛋白A，用Q柱可以高效的穿透纯化。
酶切后经过Q柱纯化，蛋白A的SDS-PAGE纯度可以达到95%以上，基本上看不到明显的杂带。但做反相HPLC检测，纯度只有85%左右。由于两种检测方法的原理不同，样品中可能含有一些小分子的杂质，电泳检测不到，而反相HPLC可以检出。还有一个可能，就是酶切毕竟是个蛋白酶的水解过程，特异性再好也有错切的时候。也许有少量的蛋白A被多降解了几个氨基酸。另外就是目标蛋白质本身可能有高级结构方面的差异。回想起来，那可是一段沮丧的日子。革命尚未成功，同志仍需努力。
（6）SP Sepharose FF柱纯化
pH5.8，20mM PB平衡SP柱，Q柱穿透样小心调节pH5.8后上样SP柱，目标蛋白吸附于柱上。 pH5.8，20mM PB，90mM NaCl洗脱杂蛋白峰。然后从90mM—300mM NaCl做线性梯度洗脱。分段收集洗脱峰，HPLC检测。
点评：此步SP柱纯化是关键性步骤，使得目标蛋白从SDS-PAGE纯度95%上升到HPLC纯度大于95%。
一般对离子交换层析来说，与等电点相差2个pH单位就可以有效吸附。此步的缓冲体系pH为5.8，这个差值达到了4，比较特殊。确定此pH值经过了多次的小试研究，高点的pH蛋白A都难以吸附完全，也不利于梯度洗脱分离，这点当时很难理解。后来在研究蛋白A的理论滴定曲线时，终于找到了理论依据。原来蛋白A的理论等电点虽然为9.7，但在滴定曲线上，从9.7到6.5的很长一段曲线都是平缓的。也就是说从pH9.7到pH6.5，蛋白A所带的净正电荷都很少，只有0—1个单位左右。当pH为5.8时，蛋白A的净正电荷达到3个单位，这时才能有效吸附。通过本例也可以发现，决定蛋白吸附的不是等电点的差异多少，而是所带净电荷的多少。可能一个蛋白质x比蛋白质y的pI高，但在某个pH时，蛋白y可以吸附阳离子柱，而蛋白x却吸附不好。所以，在理论上，做纯化要善用滴定曲线的差异，特别是小分子的蛋白质，它们普遍有着净电荷与pH不敏感的现象。
90mM NaCl洗脱杂蛋白峰和后面的线性梯度洗脱都是多次小试试验优化的结果。细心点的战友可能会发现，此步中，样品在上柱前调节完pH后并没有经过换液或透析操作，就直接上样了。样品的pH从8.0调节到5.8，体系的电导值会增加很多。大约会从2ms/cn上升到8ms/cn左右。通常这种样品是不能直接上样离子交换柱的。但本例的蛋白A在pH5.8时吸附SP柱很好，90mM NaCl不会洗脱下，所以可以直接上样。在做工艺优化时，也是有意识的想省略掉换液操作这一步，而将体系的pH适当降低了，实际在做实验时，pH6.2条件蛋白A也可以吸附SP柱，但样品的电导值必须降低，也就是要做换液操作或大量稀释。
线性梯度洗脱，分段收集洗脱峰是本工艺中的一个弱点。蛋白A的总纯化收率主要损失在这一步。做过不少试验，想把梯度洗脱改成分段洗脱方式，均未获得成功。可能是杂质与目标蛋白的差异很小吧，分段洗脱对收率的影响更大。好在本例的蛋白表达量很高，而且作为药用蛋白的使用量很低，所以纯化收率的多少对生产的总成本影响不大，它的生产成本主要在冻干和包装上。
