前 言
碱性卵白酶（又称丝氨酸卵白酶）是能使卵白质水解成肽或氨基酸的酶的总称包罗动物发生的胃卵白酶和胰卵白酶、由植物发生的木瓜朊酶和由微生物发生的霉菌卵白酶。 碱性卵白酶对去除奶渍、汗渍、血渍及肉汁等卵白质类污渍很有用果使不溶性的卵白质污渍剖析成可溶性氨基酸和肽从而去除这些污渍。普遍存在与细菌、 放线菌和真菌中研究最为普遍和深入的是芽孢杆菌的丝氨酸卵白酶。这种酶在洗涤剂、制革、丝绸等工业上有普遍用途。
1 碱性卵白酶的性子
碱性卵白酶最早发现于猪胰脏中1913年Rohm首先将胰卵白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士学者Jaag等发现微生物能发生碱性卵白酶如芽孢杆菌属细菌和曲霉属的真菌等从而使卵白酶应用拓展到洗涤剂工业。近20年来随着新的产碱性卵白酶菌株的不停分散和发现碱性卵白酶的研究有了很大的生长。迄今已有多种微生物泉源的碱性卵白酶被纯化和判定。
昆虫病原菌产卵白水解酶的报道很少。自60年月始有关耳霉属菌株排泄碱性卵白酶的报道日渐增多研究日益深入。研究讲明耳霉能发生高分子量的碱性卵白酶A和低分子量的碱性卵白酶B。
冠状耳霉排泄的碱性卵白酶B分子量卵白为6800是迄今为止报道的分子量最小的碱性卵白酶。它的最适pH 97最适反映温度45℃。该酶经50℃时1小时后完全失活。该酶具有普遍的底物专一性能催化水解多种自然卵白质（如酪卵白血红卵白卵清卵白牛血清白卵白）其中酪卵白是最适底物。此外，碱性卵白酶B还具有一定的酯酶活性，可专一性水解苯赖氨酸和苯甘氨酸衍生物L－型异构体酯键的羧基，而D－型异构体不受酶处置赏罚的影响。可用于分散氨基的消旋混淆物。可望取代现在工业上用来分散DL－旋光异构体的枯草芽孢杆菌卵白酶。与其它产碱性卵白酶菌株相比，冠状耳霉能排泄高比活力碱性卵白酶。如地衣芽孢杆菌株2709碱性卵白酶比活力为1800u/mg卵白，枯草芽孢杆菌碱性卵白酶比活力为880u/mg卵白，短小芽孢杆菌碱性卵白酶比活力为36024u/mg卵白，嗜麦芽假单胞菌碱性卵白酶比活力为1173u/mg卵白。按相同活力单元比力，冠状耳霉碱性卵白酶比活力约是我国最高碱性卵白酶比活力的1500倍。虽然效果是惊人的，但这究竟是已被证实的事实。
2 酶的发酵生产
冠状耳霉碱性卵白酶大规模生产资料较少。为了获得既高又具商业价值的酶产量，一要获得优良的冠状耳霉产酶菌株，二要优化生长和产酶造就基，三要研究该菌的发酵条件。对生长和产酶造就的研究讲明，蔗糖为最佳碳源，硝酸铵为最佳氮源，酪卵白为最佳诱导剂，但未发现外貌活性剂(SDS，Tween 20，80)对产酶有益，也未发现造就需要任何特殊金属离子。在pH 70-75，接种量为12％(v/v)，造就温度为28℃下起始发酵，酶活在48小时可达最高。
与通俗微生物一样,基因重组菌的发酵生产水平不光和菌种的遗传特征有关,也和发酵工艺控制以及发酵罐的性能有着亲近的关系。合理的发酵工艺控制可以给微生物提供优秀的情况,提高细胞水平的调控,提高目的产物的生产水平。卵白酶是工业酶种中用的最多的一种酶,约占酶总量的60%,而碱性卵白酶又占了卵白酶的市场销售额的50%以上,它在洗涤剂、食物工业和皮革制造中施展庞大作用,现在,海内外市场上对碱性卵白酶的需求量增加很快。
自从Jacobs通过建设基因文库克隆了第一条碱性卵白酶基因以来,使用基因工程的手段和卵白质工程手艺获得高产碱性卵白酶的工程菌已经是当前卵白酶研究中的一个热门。使用快速卵白液相层析,即FPLC（Fast Protein Liquid Chromatography）手艺,建设了快速高效纯化碱性卵白酶的方案,对其重组酶的酶学性子举行了研究。各种微生物对营养要求和造就条件是差此外，在分散筛选时若在这两个方面加以调治控制，就能获得更好的分散效果。
21 造就基的营养身分
各种微生物对碳源、氮源要求各异，毕业论文开题报告。有的对营养另有特殊的要求，事先相识被分散微生物的营养要求，从而设计一个合理快速的分散造就基，能够收到事半功倍的效果。
放线菌是生产酶制剂的重要泉源。在选择分散放线菌时，通常接纳改良的HV琼脂造就基、土豆-胡萝卜水汁液造就基和淀粉琼脂造就基能取得较好的效果。但差别菌种对营养要求差别很大，如奴卡氏菌在有氧条件下用通俗造就基即可分散到，而以色列放线菌则在有二氧化碳存在且有相宜造就基的情况下才气正常生长繁殖。
筛选水解酶发生菌时，通常使用以底物为惟一碳、氮源的平板举行分散，如以淀粉为碳源的造就基可判定菌落能否发生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分散造就基，可以判别纤维素酶发生菌；用含有酪卵白为有机氮源的平板造就基，可以判别卵白酶的发生菌。纯种分散时，把以上琼脂平板置于相宜的温度造就一定的时间，如具有发生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根据圈的巨细可开端判断酶活力强弱。测定水解圈直径与菌落直径之比，把比例大的菌落移入斜面收藏，供进一步筛选。
22 造就基的pH
细菌、放线菌的生长繁殖对pH一样平常要求偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此，分散造就基的pH应该调治到被分散微生物要求规模。这不仅有利于自身生长，也可清除一部门不需要的菌类。例如，分散柠檬酸发生菌的黑曲霉，就是使用调治造就基的酸碱度获得乐成的。其分散要领是取红芋粉醪20%、柠檬酸10%～20%配成造就液，调治pH20～25，以一定量的造就基和土样匀称混淆，用毛细吸管点种在平皿内事先笼罩的无菌滤纸上（2～3层），于30℃造就，这样可以分散到发生柠檬酸的黑曲霉。
分散碱性卵白酶和碱性脂肪酶发生菌时，可以把造就基调到pH9～11，在此规模内不宜生长的微生物被抑制，这对分散自己起到浓缩作用。大多数水解酶的生长最适pH基底细近，而酶的作用pH未必与产酶pH相同。造就基的pH要联合营养身分和造就条件来思量。由于微生物在生长繁殖历程中，由于代谢作用会发生酸性或碱性产物，pH发生变化，微生物生长受到抑制。一样平常造就基中碳氮比（C/N）高者，造就后倾向于酸性，反之则倾向于碱性。无机盐的性子也会影响pH变化，（NH4）2SO4是心理酸性无机氮源，其中NH4+被菌体使用，留下SO42—，造就液酿成酸性。而NaNO3是心理碱性氮源，其中NO3—被菌体剖析使用后，剩余Na+，使造就液酿成碱性。如发酵历程缺氧，则代谢向有机酸合成偏向举行，pH下降。为了维持造就基的pH，一样平常要加磷酸盐，如K2HPO4、KH2PO4，使造就基具有一定的缓冲能力。若是造就液中的酸碱变化很大，磷酸盐的缓冲容量不足以调治pH变化，则可适当加入碳酸钙，以不停中和菌体代谢历程中发生的酸类，使造就基的pH能保持在恒定的规模内。此外，在分散霉菌时，加几滴乳酸不仅可以维持一定酸碱度，而且可以抑制细菌的生长。
23 清除不需要的菌类
接纳调治pH的要领来抑制非目的微生物的生长，虽然能起到一定的作用，但不是对所有的菌类都有用。有些细菌和放线菌同样可以在酸性情况下生长，而个此外霉菌，也同样可以在中性或偏碱的造就基中生长。为了更有用地抑制非目的微生物的生长，要加入一些专一性的抑制剂。
（1）分散细菌时，在造就基中加入浓度为50U/ml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生长。
（2）分散放线菌时，在样品中加入005%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素（08mg/L）也可以有用地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。
（3）分散霉菌和酵母菌时，在造就基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml，可以抑制细菌和放线菌生长。
（4）分散根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易伸张成片，难以获得纯化的菌落，通常在造就基中添加01%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝伸张，使菌落长得小而精密。
一样平常用于分散单一目的微生物的造就基中均含有抑制其他微生物的抑制剂，这些专用的抑制剂在小型实验室配制较贫苦，现已有制品供应，只要直接加入基础造就基即可。如氨苄西林，主要用于分散亲水气单孢菌。
24 控制造就温度
控制造就温度，也是一种获得目的微生物的有用措施。各种微生物生长温度差别，从大规模来看，可分三大类一类是高温微生物，最适温度在50～60℃。若是要分散这类菌可将分散造就基置于50～60℃温度下造就，能抑制一些嗜冷、中性微生物生长，可以有用地分散到高温菌类。第二类是中温微生物，它们的最适生长温度是20～40℃，凌驾50℃，就制止生长。这类微生物最为常见，、数目都占首位。工业发酵微生物绝大多数都属于此类。其中差别类群微生物对温度又有所差别，一样平常细菌、放线菌最适温度为25～37℃，霉菌和酵母最适温度为20～28℃。第三类为低温微生物，它们的最适温度为15℃或更低。当从样品中分散各种菌类时，划分置于自身最适温度下造就也可大要上抑制另一些微生物的生长。当分散某些特殊产物的微生物时，对温度的选择还需思量某些内在的关系，如在筛选不饱和脂肪酸发生菌时，由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高，其凝固点越低，即细胞在较低温度下仍能表现出活力，因此在低于正常温度10℃下分散效果最好。
25 厌气菌的分散
好气菌要在有氧条件下造就，嫌气菌要在厌氧状况下才气生长。工业发酵所用菌种为厌气菌的有丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌，白酒增香用的丁酸菌、己酸菌及用于情况污水处置赏罚和水产养殖用的光合菌、反硝化菌、脱氮排硫杆菌等。它们生长于水底层及沉积物中，要从样品中分散这类菌，需接纳厌气造就法，否则菌体因接触氧气而殒命。因此，造就历程中要除去氧气，现先容如下几种要领
251 加还原剂
分散造就基内加入还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速率划线分散，然后立刻置于事先已抽真空密闭的容器内（充CO2或N2也可），于室温造就。
252 焦性没食子酸法
焦性没食子酸和NaOH相互反映除去氧气。操作时，先将焦性没食子酸放在容器中，把含有厌氧菌样品的造就皿排挤放入容器内，然后加入NaOH溶液，立刻盖上盖子，用石蜡或凡士林密封，放到室温下造就。要除去100ml空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10ml。
253 平皿厌气造就法
取无菌造就皿一套，在皿盖内 到上分散造就基，凝固后，皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放10%NaOH溶液，使二者不相接触。准备完毕，在凝固的琼脂平板上迅速把含厌氧菌样品举行划线，然后盖上皿盖密封，摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混淆，发生化学反映，除去皿内的氧气，置相宜温度下举行造就。
3 酶的重组法生产、纯化和性子
3.1 差别转速对重组菌产酶的影响
地衣芽孢杆菌产碱性卵白酶是耗氧发酵历程,可以改变搅拌转速来调治通宇量。搅拌转速的增加,在一定规模内可以显著提高溶氧,搅拌转速凌驾一定值后就不在成为提高溶氧的限制因素。猛烈的搅拌除了消耗大量功率外,还会使发酵液发生大量泡沫,搅拌叶的剪切作用也会造成细胞的损伤,使菌体提前自,产酶量降低。因此,对产酶而言,存在一个最佳搅拌转速的问题。搅拌对泡沫的影响很大。一样平常发酵罐接种后加大风量和搅拌,会使泡沫多到无法控制。一样平常发酵前期风量不需要很大,此时菌体呼吸虽然兴旺,但菌体数目尚少,总的耗氧量不高,应先开小风量逐步加大,待菌体浓度到达一定水平以后,再加大风量,同时用消泡剂消除泡沫。通过准备实验确定本实验中接纳前期透风10.15,后期透风10.2,效果显示(图1),在500ｒ/min搅拌转速下发酵水平最高,为ｕ/ ml;700ｒ/min搅拌转速下发酵水平次之,300ｒ/min搅拌转速下发酵水平最低。而原出发菌株在500ｒ/min搅拌转速下,发酵水平为9040ｕ/ml;重组菌的发酵水平比出发菌株提高了170.8%。
3.25Ｌ发酵罐造就条件下生长曲线的测定
碱性卵白酶是在菌体生长对数后期排泄表达,随着芽孢的形成而快速消逝。在500ｒ/min下,测定发酵历程中菌体的生长情况。从图2可知,菌体在24～32ｈ内生长迅速,以后细胞略有增加,36ｈ左右处于稳固期。在充实溶氧的条件下,菌体密度最高可到达87亿个/ｍＬ(由于造就基粘度很大,杂质较多,无法用ＯＤ值法以及细胞干重法检测,以是接纳细胞计数法)。与图1中效果比力可知,菌体的生长和酶活的变化趋势基本一致,菌体生长到40ｈ左右到达最大值,酶活最高值在40ｈ左右到达最高,因此可以确定发酵终点为40ｈ。
3.3发酵历程中还原糖及ｐＨ的变化
从图3中可以看出,造就基中的还原糖随着细胞需求量的增大而逐渐下降。在20～30ｈ细胞生长速率加速,细胞对氧的需求加大,以是此时较高搅拌速率可以改善溶氧,否则发酵液中往往会形成溶氧低谷,甚至ＤＯ值掉零,从而大大影响细胞的生长,难以提高菌体的密度。
3.4重组酶的制备及其纯化
重组酶的纯化的历程如表1所示。重组酶纯度提高了76.2倍。
3.5SDS PAGE剖析
网络Sephadex G75层析所得的活性峰酶液浓缩,取10μＬ浓缩液上样。效果显示获得单一电泳条带,分子量为28ｋＤ(图4)。
3.6重组酶的最适ｐＨ
划分接纳Ｈ3ＰＯ4 ＮａＨ2ＰＯ4(ｐＨ4～5)、ＮａＨ2ＰＯ4 Ｎａ2ＨＰＯ4(ｐＨ6～8)Ｎａ2Ｂ4Ｏ7.ＮａＯＨ(ｐＨ9～14)组成的缓冲9,用0.1ｍｏｌ/Ｌ的差别ｐＨ的缓冲液配制成1%浓度的酶液,以酪卵白为底物,在40℃反映10min。测定纯酶在一系列ｐＨ下的活力(图5)。效果讲明,酶的最适ｐＨ在11左右。
3.7重组酶的最适温度
用差别ｐＨ11缓冲液配制的酶液,以酪卵白为底物在差别温度中反映10min,测定纯酶在差别温度下的催化活力。效果讲明(图6),该酶在55℃～65℃之间活力最高,而酶在40℃时的活力仅为60℃时的37.5%左右。
3.8ｐＨ对重组酶的稳固性的影响
用差别ｐＨ的缓冲液配制的酶液,40℃处置赏罚60min,再用ｐＨ11的缓冲液将其稀释一定浓度,而且使ｐＨ值均到达统一测定值,测剩余酶活力。效果讲明(图7),酶在ｐＨ6.5～12.0之间均保持80%以上的活力,说明该酶具有较强的耐碱性。
3.9重组酶的热稳固性研究
将纯酶用ｐＨ11的缓冲液稀释后中,经由差别温度保温,按一定时间距离在40℃下测定其剩余活力。效果见图8,55℃保温2ｈ,酶活力依然保持在80%以上,随着温度的升高,酶的热稳固性下降,60℃时,酶的半衰期为2ｈ。65℃保温20min,剩余活力为33.7%。说明重组酶具有较好的热稳固性。
3.10金属离子对重组酶活力的影响
用经由稀释的酶液将金属离子配制成1ｍｍｏｌ/Ｌ的溶液,总体积2.5ｍＬ。40℃保温10min后测酶活。每组均设对照管(无金属离子)。
效果讲明(表2),Ｃａ2+、Ｍｇ2+对酶稍有激活作用,而Ｈｇ2+、Ａｇ+对酶有显着抑制作用。Ｎａｋａｍｕｒａ10等指出,Ｃａ2+对许多酶都有稳固掩护作用,尤其对耐热酶的热稳固性有很强的掩护作可用,由于Ｃａ2+能资助酶的三级结构越发稳固。Ｍｇ2+是否有这样的作用现在的研究尚不明确。
3.11化学试剂对重组酶的影响
将差此外化学试剂与酶液混淆,使化学试剂的终浓度为1×10-3ｍｏｌ/Ｌ,40℃保温10min后测酶活。每组均设对照管。
效果讲明(表3),酶的活性被苯甲基磺酰氟(ＰＭＳＦ)和二异丙基氟磷酸(ＤＦＰ)强烈抑制,由于其活性中心为丝氨酸残基,化学修饰后引入的基团阻碍了底物与活性中心的联合,或改变了活性中心四周的电荷性子从而影响酶的活性,这方面的研究现在尚无明确的结论。 乙二胺四乙酸(ＥＤＴＡ)对酶稍有激活作用,而外貌活性剂SDS和Urea对酶活的影响不大。
4 碱性卵白酶活力测定
酶活力是指酶催化某些化学反映的能力。酶活力的巨细可以用在一定条件下它所催化的某一化学反映的速率来表现。测定酶活力现实就是测定被酶所催化的化学反映的速率。
酶促反映的速率可以用单元时间内反映底物的淘汰量或产物的增加量来表现，为了敏捷起见，通常是测定单元时间内产物的天生量。由于酶促反映速率可随时间的推移而逐渐降低其增加值，以是，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反映的初速率。
碱性卵白酶在碱性条件下，可以催化酪卵白水解天生酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混淆物）发生福林酚反映。（福林酚反映福林试剂在碱性条件下极其不稳固，容易定量地被酚类化合物还原，天生钨蓝和钼蓝的混淆物，而出现出差别深浅的蓝色。）使用比色法即可测定酪氨酸的天生量，用碱性卵白酶在单元时间内水解酪卵白发生的酪氨酸的量来表现酶活力。
4.1 制备酪氨酸尺度曲线
(1) 取7支试管，编号，按下表配制差别含量的酪氨酸溶液。（见下页）
(2) 在上述7支试管中，划分加入1%酪卵白溶液1ml，于40℃水浴中保温15分钟，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充实摇匀，各管划分用滤纸过滤。
(3)划分吸收滤液1ml放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充实摇匀，于40℃水浴中保温15分钟，然后于每管中各加入3ml蒸馏水，充实摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制尺度曲线。
|
试管编号 |
酪氨酸含量 （μg ） |
1㎎/ml酪氨酸 尺度溶液（ml） |
蒸馏水 ( ml ) |
|
0 1 2 3 4 5 6 |
0 100 200 300 400 500 600 |
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 |
2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 |
4.2 样品测定
(1)准确称取干酶粉2克，加入10ml pH10缓冲溶液，在小烧杯中消融，用玻璃棒搅拌，静止片晌后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部门再加入少量缓冲液，云云重复搅拌消融4次，最后所有移入200ml容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充实摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸收滤液5ml，，移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释2000倍的酶液。
(2)取3支干燥的试管，按下表编号，严酷根据表中顺序加入试剂和操作。
|
试管编号 试剂 |
对照 |
1 |
2 |
|
PH10缓冲溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
|
12000碱性卵白酶(ml) |
1 |
1 |
1 |
|
0.4mol/L三氯醋酸溶液(ml) |
3 |
0 |
0 |
|
1%酪卵白溶液(ml) |
1 |
1 |
1 |
|
40℃水浴保温(分钟) |
15 |
15 |
15 |
|
0.4mol/L三氯醋酸溶液（ml） |
0 |
3 |
3 |
摇匀后，各管划分过滤，吸收滤液1ml，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充实摇匀，于40℃水浴保温15分钟，然后每管各加入3ml蒸馏水，摇匀。用721型分光光度计在波长680nm处，以对照管为对照，测定两管的光密度。
4.3 实验效果剖析
本实验中碱性卵白酶活力单元的界说
（1）克碱性卵白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪卵白能发生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单元。
（2）本实验中碱性卵白酶活力单元的盘算
每克碱性卵白酶的活力单元 = m / t ×f
m 样品所测定的光密度值，经查尺度曲线求得的酪氨酸量（μg）
t 酶促反映的时间
f 酶的稀释倍数，本实验中f = 2000
5 碱性卵白酶的应用与展望
碱性卵白酶作为工业用酶被普遍地应用于食物，制革，洗涤剂等工业。现在在应用上主要是解决该酶的热稳固性和相容性问题，以利于提高该酶作为添加剂的效力，扩大其应用规模。外洋有学者针对冠状耳霉碱性卵白酶只在40℃以下稳固的弱点，研究了提高该酶热稳固性的要领。研究讲明，25 mM氯化钙能使酶在50℃时的半衰期由17分钟提高到47分钟，1M的甘氨酸使酶在50℃的半衰期从17分钟提高到42分钟，钙离子和甘氨酸的联互助用能使酶在50℃时一小时之后残留酶活为43％。冠状耳霉碱性卵白酶与商业洗涤剂的相容性随品牌差别而异。虽然，现在洗涤剂行业上应用的细菌卵白酶有较好的热稳固性，如来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothmophilus)的碱性卵白酶在70℃稳固24小时，在钙离子掩护下，85℃的半衰期达4 小时。可是，在生长中国家， 洗涤剂通常在室温28℃下使用，因此40℃以下稳固的冠状耳霉碱性卵白酶仍有希望应用于洗涤剂行业。
昆虫病原真菌冠状耳霉碱性卵白酶pH稳固性，热稳固性，底物专一性以及与商业洗涤剂相容性的研究效果显示它具有应用于洗涤剂及其它行业的潜力。外洋已注意到昆虫病原真菌冠状耳霉排泄的碱性卵白酶的应用潜力。海内有学者也首次举行了冠状耳霉自然菌株产酶特征的研究。研究讲明，冠状耳霉所发生的碱性卵白酶水解卵白质的能力极强，但排泄量极低。若能提高发酵单元，设计合适的提纯工艺，该酶的应用远景将十分灼烁。有关事情正在举行当中。对冠状耳霉排泄碱性卵白酶的研究，不仅有利于富厚我国碱性卵白酶及其生产菌种的种类，而且为开发昆虫病原真菌的富厚资源积累履历。
结 论
碱性卵白酶作为工业用酶被普遍地应用于食物，制革，洗涤剂等工业。现在在应用上主要是解决该酶的热稳固性和相容性问题，以利于提高该酶作为添加剂的效力，扩大其应用规模。现在面临的问题和手艺革新后可行性及弱点
1.现在的冠状耳霉碱性卵白酶只能在40℃下处于稳固，以是改变其耐受高温性是当下要解决的问题。
2.通过基因重组实验获得的冠状耳霉碱性蛋白酶可在75℃下稳固，这是一个重大的突破。
3.弱点就在于虽然可以在75℃下稳固，但连续时间只有不足4小时，如能革新手艺提高酶的高温活力和耐受时间则可带来很大的经济效益
致 谢 词
本论文是在我的导师党秋玲的亲热眷注和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，字斟句酌的事情作风，深深地熏染和激励着我。从课题的选择到项目的最终完成，党先生都始终给予我仔细的指导和不懈的支持。两年多来，党先生不仅在学业上给我以经心指导，同时还在头脑、生涯上给我以无微不至的眷注，在此谨向
党先生致以诚挚的谢意和高贵的敬意。
在此，我还要谢谢在一起愉快的渡过大学生生涯的宁静系列位同们，正是由于你们的资助和支持，我才气战胜一个一个的难题和疑惑，直至本文的顺遂完成。
在论文即将完成之际，我的心情无法清静，从开始进入课题到论文的顺遂完成，有几多可敬的师长、同砚、朋侪给了我无言的资助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要谢谢造就我长大历尽艰辛的怙恃，谢谢你们。
参 考 文 献
1 薛林贵; 我国碱性卵白酶的应用及研究希望;微生物学转达; 1997年06期; 370-371
2 方海红,方海红,胡好远,黄红英,张林普,吕正兵; 微生物碱性卵白酶的研究希望;微生物学转达; 2002年02期;
3 LAEMMLI U K; Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 M;Nature; 1970年
4 李佳,刘克武; 微生物碱性卵白酶研究希望;四川食物与发酵; 2004年01期;
5 邱秀宝 ,程秀兰; --新的生化试剂碱性卵白酶;微生物学转达; 1982年05期;
6 徐威,苏昕,李福德; 碱性卵白酶发生菌的筛选及发酵条件考察;生物手艺; 1997年03期;
7 Margesin, R, et al; Properties of cold-adapted microanisms and their potential role in biotechnology M;Biotechnol; 1994年
8 Schirmer,F.et al; Extracellular protease-producing psychrophilic bacteria from high alpine habitats M;Arctic Alp Res; 1992年
9 朱祚铭，张秀明，刘颖，高才昌; 地衣芽孢杆菌碱性卵白酶的热稳固性研究;南开大学学报(自然科学版); 1996年02期; 105-109
10 徐威,周丽娜,邓卫斌; 紫外线诱变选育碱性卵白酶高产菌株;微生物学杂志; 1997年01期; 18-21
11 朱欣华,谢芳,黄静,邢自力,吴自荣; 枯草杆菌碱性卵白酶基因诱导表达载体的构建;微生物学转达; 2003年06期; 24-28
12 陈向东,彭珍荣,沈萍; 碱性卵白酶高产菌株的选育;武汉大学学报(理学版); 2003年06期; 92-95
13 杨金龙,潘康成,赵小林; 高产碱性卵白酶地衣芽孢杆菌的研究希望;河南农业科学; 2005年01期; 59-61
