摘 要 采用钒钼酸铵法对中性植酸酶的酶学性质进行了研究，并对酶活的测定条件进行了摸索。研究结果表明，该酶的最适反应温度为48 ℃；最适反应pH值为6.0；在pH值5.0～6.5之间有较大的活性区间；有较强的耐酸性，在pH值2.0～9.0之间处理1 h仍有90％以上的活性；具有很强的耐热性，经湿热试验箱85 ℃、95% RH处理5 min酶活能保存70％左右；Zn2+离子对酶活有一定的抑制作用，Mn2+离子对酶活有一定的激活作用；该酶抵抗胃蛋白酶的能力比较强，抵抗胰蛋白酶的能力较弱；该酶的米氏常数Km=0.563 mmol/l，最大反应速度Vmax=6.250 μmol/(mg·min)。
关键词 中性植酸酶；酶学性质；钒钼酸铵法
中图分类号 S816.7
植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称[1]。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量以及动物粪便中无机磷的排出，降低植酸磷的抗营养作用，促进动物生长发育，减轻环境的磷污染，提高畜牧生产和生态效益[2]。
随着饲料工业的发展,植酸酶作为一种新型的饲料添加剂已广泛用于饲料加工中,近年来,人们越来越关注养殖业中排放磷对环境的污染。由于酸性植酸酶酶促反应的pH值有效作用范围在2.5～5.5,所以它仅适用于胃pH值呈酸性的单胃畜禽动物及少数鱼类(如虹鳟)等,不适用于消化道为中性的鲤科鱼类和禽畜消化道中呈中性的部位[3]。本文以中性植酸酶为研究对象,研究了其最适反应温度、最适反应pH值、pH值的稳定性、耐热性、底物浓度以及该酶的米氏常数和最大反应速度，并对酶的检测条件做了相应分析，为中性植酸酶的应用和生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中性植酸酶由武汉新华扬生物股份有限公司生产。
试剂为植酸钠、钼酸铵、钒酸铵、无水乙酸钠、牛血清白蛋白、磷酸二氢钾。
1.2 主要实验仪器
紫外可见分光光度计、电子分析天平、可调恒温水浴锅、精密pH计等。
1.3 酶活力测定
采用《饲用中性植酸酶活性的测定——分光光度法》所规定的方法(新华扬企业标准)测定酶活力。
1.4 实验方法
1.4.1 检测条件的分析
1.4.1.1 标准曲线的线性范围
采用钒钼酸铵法（见1.3）。准确称取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100 ml容量瓶中,用乙酸缓冲液溶解,并定容至刻度,浓度为50.0 mmol/l。用乙酸缓冲液稀释成不同的浓度，与待测试样一起反应测定。以吸光值为横坐标，无机磷的量为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax+b)。
1.4.1.2 反应时间的选择
将酶反应不同的时间（10~70 min），计算无机磷生成量与时间的关系。
1.4.1.3 酶浓度对酶活的影响
将酶稀释不同的倍数（10 000~50 000），观察酶分子的浓度对测定结果的影响。
1.4.1.4 离子强度对酶活的影响
配制不同浓度的乙酸-乙酸钠缓冲溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 mol/l,在常规条件下测定酶活。
1.4.1.5 底物种类比较
分别用国产植酸钠和Sigma植酸钠配置底物进行酶活检测，比较检测结果。
1.4.1.6 底物浓度对酶活的影响
配制不同反应浓度（0.02～1 mmol/l）的底物，在常规条件下测定酶活，以最高酶活为100％，在其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此底物浓度下的相对酶活。
1.4.1.7 底物存放时间对酶活的影响
配制10 mmol/l的植酸钠溶液存放在4 ℃条件下，观察存放时间对酶活测定值的影响。
1.4.2 酶反应的最适温度
调节恒温水浴锅,在不同温度下(15～55 ℃)进行酶促反应。以最高酶活为100％,在其它条件的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此温度条件的相对酶活。
1.4.3 酶反应的最适pH值
配置0.1 mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,在不同的pH值下(2.0～8.0)进行酶促反应。以最高酶活为100％,在其它条件的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此pH值条件的相对酶活。
1.4.4 酶的pH值稳定性
用不同pH值的缓冲液在30 ℃下处理酶溶液30、60 min，然后调回最适pH值，在常规条件下测定酶活，考察酶在30 ℃下的pH值稳定性。以剩余最高酶活为100％，其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在此pH值条件的相对酶活。
1.4.5 酶的耐热性
模仿饲料实际调质和制粒加工条件，观察酶样品在湿热条件下的酶活变化。称取适量酶样品（粉酶与载体质量比为1：20）先与高能量载体充分混合（淀粉+面粉+玉米芯粉），然后置于85 ℃、相对湿度95%的恒温恒湿箱中处理5 min，取出待其自然冷却，再在常规条件下测定酶活，以酶样品的原酶活为100％，经过恒温恒湿处理后的酶活占原酶活的百分数即为该酶在此条件下的相对酶活。
1.4.6 金属离子和螯合剂对酶活的影响
在缓冲液中分别添加质量分数为0.1％的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeCl2、NaCl、KCl、MnSO4、(NH4)2SO4、EDTA-Na2，在常规条件下测定酶活。
1.4.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶对酶活性的影响
在稀释好的1ml酶溶液中，先分别加入1 ml浓度为0.5 mg/ml的胃蛋白酶（用pH值为2.5，浓度为0.1 mol的缓冲液配制）和胰蛋白酶（用pH值为7.0，浓度为0.1 mol的缓冲液配制），然后在37 ℃分别处理30、60、120 min后，最后在常规条件下测定酶活。以未处理的酶活为100％，在其他条件下的酶活占其酶活的百分数即为该酶在此条件下的相对酶活。
1.4.8 中性植酸酶的酶动力学参数
配制不同浓度的植酸钠溶液，在常规条件下测定酶活，利用Lineweaver-Burk双倒数作图法确定米氏常数Km和最大反应速度Vmax。
2 结果与分析
2.1 测定条件的分析
2.1.1 标准曲线的线性范围（见图1）
确定酶解产物与吸光度的标准曲线的线性范围是酶活测定的前提,实验发现,磷酸二氢钾浓度的线性范围为:磷酸二氢钾浓度1~5 mmol/l,吸光度0.165～0.875。
如图2所示，在70 min反应时间内，无机磷生成量与反应时间成正比例，为了统一测定方法，我们选择30 min的反应时间。
2.1.3 酶浓度对酶活的影响
反应体系中，酶分子的浓度对测定结果也有重要影响。表1是中性植酸酶酶活测定值与样品稀释倍数的关系。
确定酶浓度就是确定酶分子的数量与底物分子数量之间的比例关系,只有二者的比例在一定的范围内,酶分子的活力才能发挥最大的作用。实验发现,酶活随着酶浓度的升高有逐渐降低的趋势,同时,随着酶浓度的升高样品的本底值也逐渐加大。因此,在酶活测定做样品稀释时,间隔不要太大,最好是倍增稀释。
2.1.4 离子强度对酶活的影响（见图3）
如图3所示，随着离子强度升高，酶活检测值有所升高。溶液的离子强度影响酶分子的空间构象，从而影响了酶分子活力的发挥，在酶活测定过程中需要统一反应液的离子强度。在实验过程中，我们选用0.1 mol/l的离子强度。
2.1.5 底物种类对酶活的影响（见表2）
实验结果表明，用Sigma植酸钠做底物，其酶活检测值相当于国产植酸钠的82.49%左右，经过反复多次的对比，两种底物的检测值都有相似的对应关系。国产植酸钠完全可以替代Sigma植酸钠用于中性植酸酶酶活的检测,同时，其价格只有Sigma植酸钠的0.5%，用国产植酸钠可以大大降低检测成本。
2.1.6 底物浓度对酶活的影响（见图4）
如图4所示，随着底物浓度的增加酶活逐渐上升，当底物浓度足够大时，酶全部被底物所饱和，此时反应速度达到最大值。随着底物浓度的增加样品空白的本底值逐渐增大，会影响酶活的测定。
2.1.7 底物存放时间对酶活的影响
大量实验表明,长时间存放的底物,会造成较高的本底值,影响测定精度。我们分析了植酸钠溶液存放在4 ℃条件下,底物存放时间对酶活的影响,结果见表3。
2.2 酶的最适反应温度（见图5）
如图5所示，中性植酸酶随着温度的增加，酶活呈上升趋势，到48 ℃酶活达到最高，温度超过48 ℃后酶活开始下降，该酶的最适反应温度为48 ℃。
2.3 酶的最适反应pH值（见图6）
如图6所示，中性植酸酶随着pH值的增加，酶活呈上升趋势，在pH值6.0达到高峰，然后随着pH值上升酶活开始下降，在pH值5.0～6.5间，能保持70％以上的酶活。
2.4 酶的pH值稳定性（见图7）
如图7所示，在pH值2.0～9.0之间该酶仍可保持90％以上的活力，保温不同的时间对酶的稳定性没有什么影响，此酶有较强的耐酸性。
2.5 酶的耐热性（见表4）
中性植酸酶经湿热试验箱85 ℃、95% RH处理5 min后，酶活仍能保存70.16％。
2.6 金属离子和螯合剂对酶活的影响（见图8）
如图8所示， Zn2+对中性植酸酶有一定的抑制作用，Mn2+有轻微的激活作用。同时，酶活的表达不依赖于金属离子的存在。
2.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶对酶活的影响（见表5）
如表5所示，用胃蛋白酶处理中性植酸酶30、60、120 min后检测，酶活残留率分别为100.03%、99.06%和95.47%，该酶有较强的抗胃蛋白酶的能力。
用胰蛋白酶处理中性植酸酶30、60、120 min后检测，酶活残留率分别为77.24%、63.55%和45.57%，该酶抗胰蛋白酶能力较弱。
2.8 酶的反应动力学参数
利用Lineweaver-Burk双倒数作图法,以1/V对1/S作图，得到一个直线（如图9）。该酶的米氏常数Km=0.563 mmol/l,最大反应速度Vmax=6.250 μmol/(mg·min)。
3 结论
综上所叙，该酶的最适反应温度为48 ℃；最适反应pH值为6.0;在pH值5.0～6.5之间有较大的活性区间；有较强的耐酸性,在pH值2.0～9.0之间处理1 h仍有90％以上的活性；具有很强的耐热性，经湿热试验箱85 ℃、95% RH处理5 min酶活能保存70％左右；Zn2+离子对酶活有一定的抑制作用，Mn2+离子对酶活有一定的激活作用；该酶抵抗胃蛋白酶的能力比较强，抵抗胰蛋白酶的能力较弱；该酶的米氏常数Km=0.563 mmol/l,最大反应速度Vmax=6.250 μmol/(mg·min)。
此酶的酶学性质与目前报道的中性植酸酶相比有一些特殊之处：①此酶具有很强的耐热性，在饲料制粒过程中有一个短暂的高温过程,一般在75～93 ℃。普通植酸酶在此高温下不可避免的失活，而中性植酸酶经短暂的高温处理酶活仍能保存70％左右，在制粒饲料中有广泛的应用前景。目前的报道中，Kim等[4]报道的芽孢杆菌Bsp DS11植酸酶在90 ℃处理10 min后酶活可保留50%。Tye等[5]报道的地衣芽孢杆菌植酸酶在95 ℃处理15 min后酶活可保留61%。②有较强的耐酸性，在pH值2.0～9.0之间处理1h仍有90％以上的活性。③最适反应pH值为6.0偏中性，在pH值5.0～6.5间，能保持70％以上的酶活。鲤科鱼类的肠道pH值在6.5到8.5的范围内，是植酸酶的主要作用场所,与此酶的最适pH值相适应。④来源于枯草芽孢杆菌中性植酸酶对钙离子具有较强的依耐性[6]，在本实验中没有发现类似现象，此中性植酸酶酶活的表达不依耐于金属离子的存在。Zn2+对该酶有一定的抑制作用，Mn2+对该酶有轻微的激活作用。
理论上说，将中性植酸酶和酸性植酸酶配合使用，可以延长植酸酶在整个动物胃肠道中的作用时间、获得更好的添加效果，王亚茹（2001）和张常明（2005）对此也做过研究。希望科研工作者加大对中性植酸酶的研究，共同促进饲料工业的健康发展！
参考文献
[1] Abulh Jullah. Asperggijjus Ficuum Phytase: Partial Primary Structure, Substrate Selectivity and Kinetic Characterization[J]. Preparative Biochem., 1988,18:459-471.
[2] 付石军, 孙建义. 中性植酸酶分子生物学研究进展[J]. 饲料工业，2005，26（16）:21-22.
[3] 李朝霞,王爱民,李小敏. 中性植酸酶高产菌株的筛选及产酶条件研究[J]. 微生物学报， 2007，34（4）：633-637.
[4] Kim Y O, Kee J K, Kim H K, et al. Cloning of therostable phytase gene(phy) from Bacillus sp DS11 and its overexpression in Escherichia coli[J]. FEMS Microbiology Letters, 1998(162):185-191.
[5] Tye A J, Siu F K Y, Leung T Y C, et al. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases form B subtilis 168 and Blicheniformis[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 59:190-197.
[6] 王亚茹,姚斌,曾红,等. 枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和酶学性质[J]. 微生物学报, 2001，41（2）：198-203.
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
吴琪，武汉新华扬生物股份有限公司，430074，武汉。
段垒、谢红云、王天运，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-04-28
