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木聚糖酶在家禽业中的应用研究进展

   日期:2011-01-27     来源:www.cnenzyme.com    作者:酶网    
核心提示:

酶是一种由活细胞产生的生物催化剂。酶的工业化制剂称为酶制剂。酶制剂具有酶的高效性和专一性,且应用方便,比单纯的酶更易获得和用于工业实际。己经在自然界发现的酶共有2500多种,申请专利的酶制剂仅100多种,其中有经济价值的只有60余种,工业化生产的酶制剂仅20种左右(姜锡瑞等,1999)。

饲料酶制剂是当前世界饲料工业重点研究和发展的方向之一。饲料酶制剂品种很多,大致可分为消化酶和非消化酶两大类。前者包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。这类酶动物自身能够合成并且分泌到消化道中,但因某些原因需要强

酶是一种由活细胞产生的生物催化剂。酶的工业化制剂称为酶制剂。酶制剂具有酶的高效性和专一性,且应用方便,比单纯的酶更易获得和用于工业实际。己经在自然界发现的酶共有2500多种,申请专利的酶制剂仅100多种,其中有经济价值的只有60余种,工业化生产的酶制剂仅20种左右(姜锡瑞等,1999)。

饲料酶制剂是当前世界饲料工业重点研究和发展的方向之一。饲料酶制剂品种很多,大致可分为消化酶和非消化酶两大类。前者包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。这类酶动物自身能够合成并且分泌到消化道中,但因某些原因需要强化这类内源酶的作用时,就需要添加帮助动物消化的外源酶。非消化酶是指动物自身不能合成和缺乏的酶,这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解抗营养因子和有害物质。主要有纤维素酶、木聚糖酶、β一葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等(呙于明和彭玉麟,2001)。酶制剂通过提高日粮养分的消化率,不仅降低因原料批次间差异对家禽生长性能的影响,同时也降低了由于家禽个体间消化能力不同所产生的生产性能差异,使家禽生产性能更加稳定、均一。

木聚糖酶在造纸、食品、能源、饲料以及环境等领域具有很大的应用价值。本文从木聚糖酶的分子结构特点、分类、在家禽上的应用效果及其作用机理等方面进行综述,提出了木聚糖酶应用研究中存在的一些问题。

1、木聚糖酶的分子结构特点及分类

广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称(方洛云等,2002),主要包括三类:a、内切一β-1,4一木聚糖酶(EC 3.2.1.8),作用于木聚糖和长链木寡糖,从β-1,4一木聚糖主链的内部切割木糖苷链,从而使木聚糖降解为木寡糖,其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖,也有少量的木糖和阿拉伯糖;b、外切-β-1,4一木聚糖酶(EC 3.2.1.92),作用于木聚糖和木寡糖的非还原端,产物为木糖;c, β一木糖苷酶(1,4- β -D-木聚糖木糖水解酶,EC 3.2.1.37),该酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基。狭义的木聚糖酶仅限于内切一β-1,4一木聚糖酶。

根据所水解的木聚糖苷键类型,木聚糖酶可分为β-1,4糖苷键木聚糖酶和β-1,3糖苷键木聚糖酶两类。陆上植物的木聚糖酶均属β-1,4糖苷键木聚糖酶,而β-1,3糖苷键木聚糖酶大都存在于海藻及海洋生物中。按木聚糖酶的序列同源性和疏水族,木聚糖酶分别属于糖苷水解酶的两个家族,即F家族(10家族)和G家族(11家族)(陆键等,2001a),属于同一家族的木聚糖酶催化区域具有同源性,可以根据已知家族的酶来推测未知酶的催化特性。F家族的木聚糖酶分子量高,结构复杂,通常生成较小的低聚糖,该家族的木聚糖酶可以作用于对硝基苯和对硝基苯纤维二糖,与底物结合需要较少数量的位点;G家族的木聚糖酶则对木聚糖有很高的特异性。

根据木聚糖酶的来源不同,可分为细菌木聚糖酶、曲霉木聚糖酶和木霉木聚糖酶。下面对不同来源的木聚糖酶的特性进行综述。

a、细菌性木聚糖酶:Wong等(1988)对来自芽孢杆菌的木聚糖酶的性质进行了测定,分子量为24KDa,最适反应pH值为6.0,最佳温度为50℃。Irwin等(1994)对嗜热单孢菌的木聚糖酶特性进行了分析,分子量为32KDa,在75℃, 18 h下酶活力为96%。某些放线菌也能产生木聚糖酶(Ethier等,1994)。目前对来源于细菌的木聚糖酶的酶学性质,研究得比较清楚。

b、曲霉木聚糖酶:Kimwa等(1995)从曲霉Aspergillus Sojae中得到了内切β-1,4一木聚糖酶的两种同工酶,分子量分别为32.7KDa和35KDa,等电点分别为3.50和3.75,这两种酶活性能明显被Mn2+和EDTA所抑制。Femandez等(1995)发现,构巢曲霉在以木聚糖为碳源时至少可分泌三种内切β一木聚糖酶:X22、X24、和X34,分子量分别为22、 24和34KDa,其中X22是中性酶,其余两种为酸性酶。此酶对木聚糖有很高的专一性,是一种非脱支型木聚糖酶,与黑曲霉木聚糖酶近似,但后者分子量较小(28KDa)。

c、木霉木聚糖酶特性:木霉是一类工业上生产纤维素酶的主要真菌,同时一些木霉也能产生各种不同的木聚糖酶。Koyer等(1991)从里氏木霉中纯化得到两种木聚糖酶,木聚糖酶A的分子量为21.5KDa,分解产物为木二糖和木三糖;木聚糖酶B分子量为33KDa,分解产物为木二糖和木糖。木二糖能抑制木聚搪酶B的酶活,而对木聚糖酶A无此效应。里氏木霉制备的木聚糖酶,水解植物半纤维素后,分离提纯该酶解液,用HCLP法分析其组成为:木糖3.4%、木二糖37.9%、木三糖18.5%、木四糖6.5%、木五糖6.5%,其它27.2%(徐勇等,2001 a)。植物半纤维素经低聚木糖酶的定向酶解后分离提纯的主要成分为木二糖和木三糖。

到目前为止,已有近百种不同菌株的木聚糖酶基因被克隆。Bemier等(1983)首先从Bacillus Subrilis PAPⅡ5中分离得到Xyn木聚糖酶基因。近年来,已经测定了许多木聚糖酶基因的完整核苷酸序列。Gat等(1994)分析了嗜热脂肪芽孢杆菌T-6的木聚糖酶基因和DNA序列;Tabemero等(1995)测定并分析了嗜碱性芽孢杆菌N137菌株编码的内切一β-1,4木聚糖酶的DNA序列。目前木聚糖酶基因分子克隆工作已把宿主菌从大肠杆菌等原核生物扩展至酵母、木霉、曲霉等真核生物。随着基因工程技术的发展,可利用生物反应器生产木聚糖酶。运用基因工程技术在分子水平上对木聚糖酶基因进行分子改造,可望解决一些木聚糖酶活性低(如抗逆性、PH值稳定性、热稳定性等)的应用问题。在饲料制粒过程中有一个短暂的高温过程(温度一般在75-93℃),一般木聚糖酶在此温度下会大幅度丧失活性,因此能在饲料中真正推广的木聚糖酶必须具有良好的热稳定性。一般来说,非淀粉多糖(NSP)酶在75℃时是稳定的。80℃时酶活损失50%以上(Pilip Lobo等,1998);另一方面饲料中木聚糖酶最终的作用场所是动物正常体温(37℃)的胃肠道中,木聚糖酶必须在常温下具有较高的活性。近年来,已从嗜温微生物中发现了多种耐高温木聚糖酶,对它们的结构与热稳定性的研究将为木聚糖酶基因的分子改造提供理论依据。

2、木聚糖酶在家禽业上的应用

2.1添加木聚糖酶对肉仔鸡生长性能的影响

大多数研究结果表明,肉仔鸡麦类日粮中添加NSP酶有一定的促进作用。Jensen和McGinnis(1957)首次报道以大麦为主的日粮中添加粗酶制剂可提高肉仔鸡的生产性能。Hesselman等(1982)通过肉仔鸡试验发现发芽大麦的营养价值高于普通大麦。因为大麦发芽时其内源性β一葡聚糖酶和木聚糖酶活性升高,部分降解大麦中的NSP。大多数研究(Friesen等,1992; Almirall和Esteve-Garcia, 1994; Boros等,1998)表明,添加木聚糖酶后可提高肉仔鸡日增重与饲料转化效率。家禽和猪在解剖和生理结构上的差异,导致了猪鸡使用酶制剂的差异(Campbell和Bedford,1992)。鸡日粮中添加酶制剂的效果要好于猪(Graham等,1986; Bedford和Classen, 1992;Marquardt等,1994)。但是,也有一些研究报道,肉仔鸡日粮中添加木聚糖酶没有效果(Ritz等.1995; Petersson等,1990)。

2.2添加酶制剂对表观代谢能(AME)和养分消化率的影响

小麦日粮中添加木聚糖酶可明显提高小麦日粮的AME (Friesen等,1991),但是提高幅度的变异比较大。小麦日粮中添加酶制剂,小麦的AME可从14.26 MJ/kgDM提高到15.24-15.79MJ/kgDM (Annison, 1992)。Friesen等(1992)报道加酶可分别提高含70%小麦、大麦、燕麦、黑麦日粮AMEn 4%, 7%, 33%和14%。Villamide等(1997)在肉仔鸡大麦饲粮中添加酶制剂(主要是β一葡聚糖酶和木聚糖酶),可提高大麦AMEn 110 Kcal/kg。Boros等(1998)报道肉仔鸡黑麦日粮中添加酶制剂可提高AMEn约12%。Fuente等(1998)报道食糜粘度和日粮AMEn呈负相关关系,加酶可提高日粮AMEn 2%, Ravindran等(1999a)报道添加酶(主要为木聚塘酶,还有蛋白酶)可提高小麦型日粮AME 2.8%。

但是,代谢试验测定的AME结果与家禽生产性能的表现不尽一致。Preston等(2000)报道加酶后尽管提高了AME,但未能提高家禽的生产性能。McCracken和Quintin (2000)认为添加木聚糖酶没有提高小麦的AME,可能是由于这种小麦的品质较好、AME 较高。木聚糖酶对能值低的小麦作用较大(Choct等,1994),而对能值高的小麦作用较小。

小麦日粮中添加以木聚糖酶为主的酶制剂可显著提高小麦的营养价值(Annison, 1992;Morgan等,1993; Schute等,1995)。添加木聚糖酶后显著改善肉仔鸡对大麦中淀粉、脂肪、蛋白质的表观消化率(Hesselman和Aman, 1986: Graham等,1989; Viveros等,1994)。小麦日粮中添加酶制剂,淀粉的消化率从88%上升到96%以上,戊聚糖表观消化率从26%上升到37%以上(Annison, 1992)。家禽能够通过改变胰腺分泌的淀粉酶和改变肠道表面积来适应日粮变化,特别是日粮淀粉。不溶性非淀粉多糖(INSP)通过阻止淀粉颗粒与淀粉酶的接近而损害淀粉的消化率(Hesselman和Aman, 1986)。Friesen等(1992)报道加酶可分别提高小麦、大麦、黑麦和燕麦的表观蛋白质消化率3.4%、5%、11%和23%。Ravindran等(1999b)报道添加酶(主要为木聚糖酶,还有蛋自酶)可提高回肠所有氨基酸的表观消化率1-2%,但只有苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸差异显著。Danicke等(1999)报道添加木聚糖酶后空肠和回肠氮和干物质的表观消化率略有提高。但另有报道,添加酶制剂未能提高氮的利用率(Aimonen和Nasi, 1991; Vukic Vranjes等,1996)。黑麦日粮中添加木聚糖酶可提高脂肪的消化率约50%(Friesen等,1992)。Viveros等(1994)发现加酶可提高脂肪和淀粉的消化率,但不能提高纤维素的消化率。

2.3 添加酶制剂对消化道发育及理化指标的影响

饲喂大麦的肉仔鸡,加酶后可降低消化道重量20%,其空肠组织学发生变化(绒毛变短、加厚、萎缩,Globet细胞的数量和大小增加)(Viveros等,1994)。Brenes等(1993)报道,无壳大麦日粮中加酶后可降低嗉囊和肌胃的相对重量15%和17%,带壳大麦日粮中加酶可降低嗉囊和肌胃相对重量7%和8%。大麦日粮加酶后降低消化道的相对重量:前胃(39%),胰脏(24%)、肝脏(8%)、十二指肠(160%),空肠(20%)、回肠(18%)和结肠(29%)。但也有报道小麦日粮加酶不影响消化道重量,而胰脏相对重量显著降低16%, Fuente等(1998)报道肠道粘度增加,消化道重量也增加,因此胴体百分率降低。饲喂大麦日粮的肉仔鸡肌胃重大于饲喂玉米豆粕型日粮的肌胃重(Forbes和Covasa, 1995; Nahas和Lefiancois, 2001),这是因为肌胃磨碎能力增强的结果。饲喂大麦日粮肉仔鸡的胰腺重和相对重量较大,这是由于内源酶活和分泌物体积增加的结果(Almirall等,1995; Nahas和Lefrancois, 2001)。加酶后降低消化道的重量,增加养分分配到可利用组织的比例,改变微生物发酵,从而提高营养物质的利用率。消化道重量的降低可能是增加养分消化利用率的适应性反应,同时也增加了加工过程中胴体的产量。

肉仔鸡大麦型日粮中添加粗酶制剂,能使胸肌率显著提高,腿肌率显著降低、肝脏体重比和心脏体重比均显著提高(韩正康,2000)。高峰等(2000)报道,肉仔鸡小麦日粮中添加。.1%的酶制剂(主要为β一葡聚糖酶和木聚糖酶),可显著提高肉仔鸡全净膛重、胴体重、胸肉重、腿肉重和脂肪重,但胴体胸肌率、腿肌率、脂肪率和屠宰率均无显著变化,这说明酶制剂促进肉仔鸡增重但不改变胴体组成和屠宰率。

韩正康(2000)报道可溶性非淀粉多糖(SNSP)会抑制与生长和代谢有关的内分泌机能。日粮中添加NSP酶,可明显改善动物的消化代谢和神经内分泌状况,提高饲料利用率和生长速度,也明显增强家禽的免疫机能。高宁国和韩正康(1997)在大麦日粮中添加0.1%复合酶,肉仔鸡血液GH, T3, T3/T4及胰岛素水平均有提高,而胰高血糖素水平降低。高峰等(2000)报道小麦日粮(60%小麦)加0.15%酶制剂后,血液中T3. T4.胰岛素、IFG-I水平分别提高17.4%、20.5%、11.6%和26.5%。艾晓杰等(2000a,b,c)在生长鹅大麦日粮(大麦占45%)中添加0.1%的酶制剂后,使血浆尿酸水平显著降低57.55%,而谷丙转氨酶比对照组提高4.46倍。肝脏中的1GF-I比血液和肌肉中分别提高59.01%和14.97%。血糖和胰岛素水平分别提高12.30%和36.75%,胰高血糖素水平降低23.11%。许梓荣等(1999)在肉仔鸡高麸皮日粮添加复合酶制剂,使血清T3,胰岛素、IGF-I分别提高58.47%, 52.37%和56.50%,但对T4和PTH水平无显著影响。

2.4酶制剂对肠道微生物的影响

饲料通过家禽的胃时,被胃内的盐酸和胃蛋白酶杀菌。食糜进入十二指肠后由于pH值的变化以及大量消化酶、胆汁、卵磷脂和溶菌酶的流入,故在十二指肠存活的细菌很少。由于胰酶的高浓度和肠细胞的高效吸收活性,肠道上段的消化效率最高(Uni等,1999).随着食糜通过小肠,分解和吸收作用逐渐下降(Campbell等,1983).如果日粮有较高的消化率,主要养分在进入适合于细菌生长环境之前就已被消化和吸收,所以肠道的微生物区系较低。而消化不良时养分进入后肠,促进微生物生长,不可避免地降解抗菌剂如胆汁(Christl等,1997)。微生物通过结合和脱羟基作用,使得这些化合物失去活性,从而损害脂肪的消化率,因为胆汁是脂肪乳化所必需的物质(Campbell等,1983)。添加木聚糖酶后提高了麦类日粮中的养分消化率,减少了进入后肠的养分量,从而抑制了微生物的生长。Danicke等(1999)报道肉仔鸡黑麦日粮中添加木聚糖酶后,显著降低了肠细菌和总的厌氧微生物。

3 NSP酶提高家禽生产性能的作用机理

3.1 NSP酶降低肠道食糜粘度

外源酶制剂大大提高某些饲料如大麦、小麦、黑麦和燕麦在家禽业上的应用(Marquardt等,1994; Zhang等,1996),这是与肠道食糜粘度降低相联系的(Hesselman和Aman, 1986; Bedford和Classen, 1992; Zhang等,1997)。

最广泛接受的机理是NSP酶降低空肠和回肠食糜粘度(Choct等,1996)。β一葡聚糖和阿拉伯木聚糖的部分水解能够相应地降低持水力和粘度,增加消化酶和养分的扩散度,降低肠粘膜未动水层厚度而提高吸收率(Johnson和Gee, 1981)。NSP酶对家禽生产性能的提高并不是由于对NSP的水解导致肠道吸收了更多单糖的结果(White等,1983; Campbell等,1986: Chesson, 1987);而是由于酶将NSP降解为小分子的多聚物(Fengler和Marquardt, 1988a; Bedford, 1992),降低了肠道食糜的粘度,抑制养分扩散的性质,消除了NSP的抗营养作用(Almirall等,1994, 1995)。Baker(1977)和Longstaf等(1988)指出即使酶完全水解戊聚糖,戊聚糖释放出来的戊糖对家禽非但无用,还可能有害。Bedford和Classen (1992)发现食糜中增加的粘度是由黑麦中可溶性的戊聚糖导致,添加木聚糖酶可消除其凝胶样的特性,食糜粘度的下降程度与生产性能的提高幅度呈高度相关。食糜粘度的降低与食糜在消化道内存留时间显著相关(Almirall和Esteve-Garcia, 1994),从而增加采食量(Albustany, 1996)。Choct和Annison (1992)用阿拉伯木聚糖酶切割NSP,发现随着粘度和分子量的减小,NSP对鸡生长性能及饲料转化率的负面影响基本消失。Malathi和Devegowda (2001)也报道饲料酶的作用主要是降低食糜粘度,其次才是释放糖。

但是,Preston等(2000)报道添加外源酶可降低肠道食糜粘度19-22%,但这对家禽生产性能没有显著影响。Kocher等(2000)报道肉仔鸡生产性能差并不是由于SNSP浓度增加、肠道粘度升高的结果,蛋白质消化率和日粮中可利用的能量是主要影响因素。因此,用粘度变化理论来解释NSP酶的作用机理,似乎过于简单。添加NSP酶后肠道食糜粘度的变化是一种现象,还是本质原因,这还有待于深入研究。

3.2 NSP酶提高养分的消化率

在麦类日粮中添加β一葡聚糖酶和木聚糖酶可提高日增重和饲料转化率,主要原因是提高了养分的消化率(Almirall等,1995; Marquardt等,1996)。淀粉消化率和AME的相关性已经很好地建立(Mollah等,1983; Rogel等,1987b; Annison和Johnson 1989),因为淀粉是日粮主要能量来源之一。已经证明谷物饲料中添加聚糖酶后可提高淀粉消化率(Hesselman和Aman, 1986;Peterson和Aman, 1989; Annison, 1992)。家禽过量分泌内源消化酶以试图分解消化率低的非淀粉多糖,这就进一步导致能量和氨基酸的损失。一些学者认为,酶制剂的主要作用机制是改善淀粉消化率和减少内源蛋白和能量的损失。

豆粕中添加酶制剂可以分解残留的抗胰蛋白酶因子和凝集素,因此可以提高蛋白质和氨基酸的利用率。尽管酶制剂可提高蛋白质消化率,但酶的效应并非对所有的氨基酸都一样。酶制剂对提高胱氨酸和苏氨酸消化率的效应较大,而对赖氨酸的效应较小,对蛋氨酸消化率则几乎没有影响。小肠内的大部分苏氨酸和胱氨酸来源于肠道内源分泌物如胰腺酶、脱落的细胞和肠道粘膜等,而大部分蛋氨酸则是来源于日粮,赖氨酸则基于二者之间(Bielorai等,1991)。由此看来酶制剂提高蛋白质消化率的主要机制似乎是减少内源氨基酸的损失。由于酶制剂提高蛋白质消化率效应的主要部分来源于非限制性氨基酸,而对限制性氨基酸如赖氨酸和蛋氨酸的改善甚微,故利用酶制剂降低配方中赖氨酸或蛋氨酸水平从而降低配方成本的机会非常有限。因此,建议在下调日粮能量或蛋白水平时应保持必需氨基酸水平不变。

3.3提高内源消化酶活性

大麦日粮中添加β一葡聚糖酶能显著提高肉仔鸡食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性,但成熟公鸡食糜无此变化。高宁国和韩正康(1997)研究发现,大麦饲粮中添加以β一葡聚糖为主的粗酶制剂,使肉鸭21日龄食糜上清液的淀粉酶活性提高75%,但蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶分别下降43.5%、24.4%、19.6%; 42日龄时,酶制剂使食糜上清液中淀粉酶活力提高16.4%,对其余的消化酶活性无影响。许梓荣和王振来(1998)在仔猪上的试验也证实,酶制剂提高了肠内容物中总蛋白水解酶、淀粉酶和脂肪酶活性。从大多数结果来看,NSP酶提高内源消化酶活性的变异较大。

3.4 NSP酶对肠道粘膜的影响

Kelsay等(1978)和Jenkins等(1978)证明高度粘性的糖类阻碍养分和大鼠小肠粘膜表面的相互接近。Johnson和Gee(1981)用瓜耳胶进行的体外研究进一步证实了上述发现,即SNSP和小肠刷状缘的糖原盂相互作用产生一厚层不能流动的水层,导致养分吸收率降低。葡聚糖和阿拉伯木聚糖的部分水解,降低了持水力和粘度,增加了内源消化酶和养分的扩散,降低肠粘膜表面的水层从而提高吸收效率(Johnson和Gee,1981)。Edwards等(1988)和Ikegami等(1990)指出小肠内容物粘度的增加会降低消化酶及其底物的扩散速率,同时阻止它们在粘膜表面上有效的相互作用。

高粘度的食糜改变肠组织的形态学(Johnson和Gee,1986),导致老鼠的上皮绒毛延长,上皮细胞周转增加(Gee等,1996)。加酶后粘度降低可能改变肠道形态学,刺激粘膜的增殖,导致定植面积减少,改变粘附结构和肠腔释放的上皮细胞(粘附细菌)。由于重吸收速率高、内源损失小、粘液和脱落上皮细胞组成变化,整个低水平的营养物质浓度导致细菌生长受阻。

3.5 NSP酶对肠道微生物的影响

Dgnicke等(1999)发现添加木聚糖酶显著降低肠细菌和总的厌氧菌,对革兰氏阳性菌也有相似趋势。这与Vahjen等(1998)报道的一致,小麦日粮中添加木聚糖酶可降低肉仔鸡肠腔内粘附细菌数量。大麦日粮显著增加粪链球菌的数量(Salih等,1991),大麦日粮对抗生素的反应比其它日粮高(Moran等,1969)。微生物定植增加了微生物和宿主对营养物质的竞争,增加了胆汁酸的降解(Feighner和Dashkevicz, 1988),而胆汁酸对饱和脂肪酸的消化是必需的。

微生物降低大麦或黑麦日粮的养分存留率,但通过添加抗生素可提高雏鸡的生产性能(Marquardt等,1979; Cave等,1990)。食糜流速降低(Gohl等,1978)和未吸收的养分的存在,促进了肠道细菌的生长(Salih等,1991)。因此,添加酶制剂影响肠道状态以及肠道微生物的组成和活性。

3.6其它原因

胰岛素样生长因子(IGF-I)是动物体内介导生长激素而促进生长的重要因子。IGF-I由肝脏产生,在血液中与特异性的运载蛋白结合,运送到相应的靶组织发挥生理效应。在家禽的快速生长期,肝脏和肌肉中较高水平的IGF-I有利于动物的生长需要。添加NSP酶后,能够促使肝脏合成IGF-I,血液中与IGFBP结合的IGF-I大量释放,并转移到肌肉中,使肌肉IGF-I水平显著升高,从而促进肌肉生长。

肉仔鸡大麦日粮中添加酶制剂后,胰岛素水平升高,胰高血糖素降低,可以认为添加酶制剂使糖类降解增强和吸收加速,从而影响血液胰岛素水平与胰高血糖素发生相应的变化而参与血糖的调节(刘燕强等,1997)。添加酶制剂后,一方面尿酸水平下降和谷丙转氨酶活性提高,说明了机体的蛋白质分解减少,合成代谢加强;另一方面,血糖含量及胰岛素与胰高血糖素的比值升高,表明机体的消化吸收改善,合成代谢加强。

另外。饲料的谷物多糖类经β一葡聚糖酶、木聚糖酶等NSP酶的降解作用,会产生多种寡糖,它们具有生理活性(韩正康,2000);可增强体内吞噬细胞活力,提高机体免疫机能;竞争性地与病原菌细胞膜结合。并与寡糖一起排出体外;寡糖可被胃肠道内某些固有栖居的微生物(有益菌)所利用,促进增殖而抑制一些外来有害微生物的生长,提高机体的抗病力(Newman, 1994)。

4、影响木聚糖酶作用效果的因素

4.1麦类的品种、来源

不同品种、生长于不同环境条件下的麦类中TNSP含量及SNSP含量均不相同(Bhaty, 1991)。酶作用底物含量的多少,是影响NSP酶作用效果的关键因素之一。一般来说,麦类日粮中NSP含量越高,添加NSP酶的效果就越明显(呙于明和彭玉麟,2001)。

4.2动物的种类与年龄

家禽由于消化道短,消化功能比较简单,添加酶制剂效果比较明显。肉仔鸡降低SNSP的负面作用是与年龄有关的(Salih等,1991; Almirall等,1995; Philip等,1995)。对鸡而言,以雏鸡(1-4周龄)的效果更为显著,4周龄以后影响不大。饲喂大麦日粮时,肉仔鸡消化道的粘度比成年公鸡的更高。小肠微生物酶活性可能随年龄增长而增加,导致部分NSP水解,从而降低食糜粘度。加粗酶制剂对肉鸭的影响以0-21日龄效果较好,对42日龄以上的肉鸭影响较小(高宁国和韩正康,1997)。

家禽日龄也影响AMEn值,30日龄测定的AMEn比10日龄测定结果要高出4.6%。添加木聚糖酶可显著提高肉仔鸡的AMEn,而对成年公鸡没有明显影响(Roter等,1990)。

4.3 NSP酶的品种、来源及其在动物体内的活性

真菌源、细菌源及动植物源的酶具有不同的最佳pH值与最适温度。He等(1993)研究了两种放线菌木聚糖酶的生化特性,发现在pH4.75-6.25之间具有最佳活性,其最适温度为40-60℃。Baas和Thacker (1996)报道,pH值在4.5和5.5时β一葡聚糖酶和木聚糖酶的活性最高;pH值在2.5以下对酶活有破坏性影响。Inborr等(1993)体外试验表明,动物肠道内低的pH值及蛋白水解酶均可使木聚糖酶部分失活。但当基质含有一定缓冲能力的物质或含有酶制剂作用的底物时,可大大增强酶对环境的抵抗能力,降低酶的失活率。Boros等(1998)根据消化道不同部位的食糜粘度、总降解糖和pH值来估计肉仔鸡黑麦基础日粮中添加外源酶的作用位点,发现小肠后段和小肠前段的后段是外源酶作用的主要部位。幼禽添加木聚糖酶对蛋白酶水解有较高的稳定性,在回肠末端仍可保留20%的酶活(Danicke等,1997)。这与Chesson (1992)的报道一致,多糖酶在腺胃可保持75%的活性,而到回肠末端可保持20%活性。

4.4其它因素

饲料中添加的其它酶制剂、矿物元素、有机酸等也影响酶的作用效果。例如植酸酶和木聚糖酶之间存在互作效应。Newkirk和Classen (1993)首先在产蛋鸡日粮中发现植酸酶和木聚糖酶有正互作效应。肉仔鸡日粮中添加植酸酶、蛋白酶和碳水化合物酶等外源酶制剂时,联合使用比单一使用的效果更明显(Chesson, 1993; Simbaya等,1996)。Ravindran等(1999a)单一添加木聚糖酶和植酸酶分别增加能值低的小麦的AME 9.7%和5.3%,同时使用这两种酶可显著提高AME19.0%。纯木聚糖酶添加到黑麦日粮没有使用粗酶制剂的效果好(Tenkanen等,1991),无法完全消除木聚糖在肠道内产生的粘性(Bedford和Classen, 1991)。其原因可能是木聚糖片段受木聚糖酶作用后仍保持较大的分子结构。

植酸酶,特别是高水平植酸酶,从植酸复合物中释放蛋白质,提高其利用率(Biehl等,1995;YI等,1996)。这些蛋白与可溶性小麦阿拉伯木聚糖凝胶基质结合而增加食糜粘度。当凝胶基质被内切型木聚糖酶破坏时,蛋白质可能被肠道蛋白酶逐渐降解,从而降低了粘度。Tervila-Wilo等(1996)进行体外消化模拟实验,显微检查发现蛋白质仅存于未破裂的细胞内,小麦的大部分蛋白质已经释放到溶液。添加细胞壁降解酶,可增加蛋白质和非淀粉碳水化合物的释放。木聚糖酶由于其解聚作用,释放包被的营养物质,降低了肠道粘度(Bedford和Margan, 1996),有利于植酸酶对植酸的作用以及游离养分的吸收。

5木聚糖酶酶活测定方法

对酶制剂中各种酶活性进行定量分析具有重要意义。首先,它是酶制剂和饲料产品质量检测的依据。酶制剂是生命活性物质,其活性随饲料的加工保存时间与条件以及饲料中其它成分的变化而变化,因此应对各个生产环节添加酶制剂的实际效价进行检测。其次,准确的酶活检测方法也是根据饲料中NSP含量和组成来合理调整添加酶的种类和剂量的依据。此外,统一的酶活测定方法还有利于不同来源的同类产品、不同研究结果之间的比较。

饲料中酶活的检测方法有:一种是检测在给定条件下酶作用底物的消失程度;另一种方法是检测在给定条件下产物的生成数量。一般采用后一种方法。

淀粉酶和蛋白酶活性的测定在AOAC中有成熟的分析方法,而β一葡聚糖酶和木聚糖酶尚无统一的分析方法。现在各大酶制剂公司对木聚糖酶的测定方法主要有:还原糖法、色原底物法、酶联免疫法和粘度法(Cowan, 1993)。

5.1还原法

通过比色法检测酶作用于底物释放的还原糖量来评价酶的活性。根据还原糖的方法不同,又可分为DNS法和砷钼酸盐法。DNS法的原理是利用3,5一二硝基水杨酸(DNS)与β一葡聚糖酶和木聚糖酶的水解产物葡萄糖和木糖共热后,测定被还原呈棕红色的氨基化合物。在一定范围之内,还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比。在540nm处测定反应液的吸光度,从而计算出生成的还原糖量。DNS法的优点是反应的颜色稳定性好,操作简单。但据Miller (1959)报道,DNS对还原性的单糖、寡糖都具有氧化能力,从而在该方法中建立的单糖标准曲线与实际饲料样品间存在误差。砷钼酸盐法的原理是利用碱性二价铜离子与还原性糖反应生成氧化亚铜,在浓硫酸存在下,将砷钼酸盐还原成兰色化合物,再进行比色分析。该法的优点是检测酶活时产生的变异较小,干扰较少,适宜微量测定。缺点是配制砷钼酸盐时需要使用毒物砷酸二氢钠,操作也比DNS法复杂,耗时长。

5.2粘度法

酶作用于具有粘性的底物而使粘度下降,利用高分子溶液在毛细管中的伯肃叶方程,通过粘度计测定流速来计算酶活。Buckee (1985)认为该法存在重复性差,单位难以换算成国际单位等缺点,从而限制了该法的推广使用。但Hadden (1995)报道,该法灵敏度高。可形象反映外源酶在动物体内的作用特点,是饲用酶活力测定的较好方法。Zhang等(2000b)报道日粮粘度法至少可检测日粮中0.19 U的木聚糖酶。尽管体外粘度法检测的结果和体内法检测的结果有较高相关性(Roter等,1990; Bedford和Classen, 1993),但由于肠道条件的变化而常导致体内法结果的变异性。

5.3色原底物法

色原底物法是80年代开发的一种新型方法,它利用人工合成底物来检测酶活,这种底物多数含有有色基团,可在酶的作用下释放出来,利用分光光度计进行检测。Barbara等(1990)对粘度法、色原底物法进行的比较试验表明,色原法和粘度法具有较高的相关性(r-0.902),但色原法重复性好,灵敏度高,而且该法测定的结果能够更好地反应动物的增重速率。该法的缺点是合成的底物并不能代表酶的天然底物。从加酶饲料中提取酶液时含有一定的天然底物,它们在测定过程中与人工底物进行竞争,从而影响测定结果的稳定性。

5.4反射琼脂扩散法

将底物与琼脂混融、冷却、制成琼脂平面,在直径4-5mm小孔中点酶样,培养一段时间后,用染色剂显色或用展开剂显示非水解区,利用水解直径和酶浓度的关系测定活力。该法的优点是所需要的样品数量少,几微升至几十微升,灵敏度高,可检出O.IU/ml的酶量。Carder (1986)的试验证明,琼脂扩散法比还原糖法灵敏度高100倍,比色原法提高10倍,是目前唯一针对饲料终产品进行酶活性准确测定的方法。

测定酶活时分析条件必须反映酶在家禽消化道内起作用的条件。体外分析方法和条件与动物体内实际情况有很大差别。影响酶活分析的因素有: a.温度:鸡体温是41℃,而酶活分析通常在30-35℃进行。因此分析的酶活与实际在鸡体内的酶活有一定差异。b, pH值:鸡腺胃pH为4.30-4.60,肌胃pH为2.8-3.0,小肠pH为6-7;而酶活性的体外测定必须在其作用目标物所具有的pH环境中进行。c、底物类型:酶活分析使用的底物的种类和浓度也能影响酶活。如果酶制剂添加的饲料含小麦而不含燕麦,酶活分析用的底物就应该为小麦木聚糖,而不是燕麦木聚糖。d、饲料中存在妨碍测定酶活的物质。如葡聚糖酶、戊聚糖酶和纤维素酶等是根据测定其反应产物还原糖的数量来检测的,还原糖可以简便地用二硝基水杨酸来测算。但所有饲料中都含有高水平的天然还原糖,这些糖同酶一起被提取进入提取液,这使得随后的酶活测定由于糖的背景值高而无法进行。使用放射渗透法可用于测定饲料中酶活,此法是酶渗入凝胶而对其中的底物发生催化作用。e、其它:如金属离子、饲料加工过程中湿热、氧化剂以及内源酶对酶制剂的活性均产生影响。

6木聚糖酶在饲料工业中应用中有待干解决的问题

6.1木聚糖酶在饲料加工过程中稳定性的研究

为了保证木聚糖酶在达到酶作用位点时还保存足够的酶活,那我们可以从以下几个方面研究:筛选耐高温的木聚糖酶:探讨在饲料加工和贮存过程中减少酶活损失的方法:研究酶制剂的包被与保护。

6.2木聚糖酶在家禽日粮中应用效果的研究

为了充分发挥木聚糖酶的作用,应该研究相关的影响因素,如底物含量与木聚糖酶添加量之间的关系、不同酶制剂之间的组合效果、添加酶制剂后替代部分营养素的可行性。

6.3木聚糖酶在家禽中的作用机理研究。

目前,木聚糖酶促进家禽生产性能的作用机理尚未完全清楚。主要争论的焦点是木聚糖酶究竟以降低食糜粘度为主,还是以提高养分消化率为主?该问题还有待于深入研究。(中国酶制剂网 www.cnenzyme.com )

 
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