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角蛋白酶研究进展 基础研究

   日期:2011-01-27     来源:www.cnenzyme.com    作者:酶网    
核心提示:

  皮肤真菌与角蛋白有着特殊的亲合关系,往往侵犯皮肤的角质层、甲、毛发等部位。20世纪40年代,科学家们相继发现许多微生物能分泌一类具有角蛋白水解活性的酶,称为角蛋白酶,并进行了有关研究,但进展缓慢。近十年来,随着分子生物学技术的发展,角蛋白酶再次成为研究的热点,并取得了明显的进展,本文就角蛋白酶的生物学特征、研究进展及其在皮肤科和美容领域的可能应用进行综述。

  1 角蛋白酶的生物学特点
  角蛋白酶是微生物产生的一类具有角蛋白水解活性的酶,许多皮肤真菌可分泌角蛋白酶,如须癣

  皮肤真菌与角蛋白有着特殊的亲合关系,往往侵犯皮肤的角质层、甲、毛发等部位。20世纪40年代,科学家们相继发现许多微生物能分泌一类具有角蛋白水解活性的酶,称为角蛋白酶,并进行了有关研究,但进展缓慢。近十年来,随着分子生物学技术的发展,角蛋白酶再次成为研究的热点,并取得了明显的进展,本文就角蛋白酶的生物学特征、研究进展及其在皮肤科和美容领域的可能应用进行综述。

  1 角蛋白酶的生物学特点
  角蛋白酶是微生物产生的一类具有角蛋白水解活性的酶,许多皮肤真菌可分泌角蛋白酶,如须癣毛癣菌、红色毛癣菌、鸡禽毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、新霉素链霉菌、密旋链霉菌、短帚霉、黄曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌等。一些细菌也可产生角蛋白酶,如栖息微球菌、表皮葡萄球菌和地衣芽孢杆菌等。Lucas FS等[1]在对牧场土壤产角蛋白酶细菌分离中发现产角蛋白酶细菌具有多样性,可为杆菌属、噬细胞菌属、放线菌属或蛋白菌属(Proteobacteria)。最近,Kim JS [2]发现一种新的细菌Fervidobacterium pennivorans 能够产生称为fervidolysin的角蛋白酶。Riffel A等[3]从家禽废物中分离出一种新的能完全降解羽毛的产角蛋白酶的细菌,经形态、生化及16S rRNA鉴定为Chryseobacterium sp菌株 kr6。角蛋白酶来源不同,其结构、理化性质、活性和底物也不同。这些酶多数属于细胞外酶,个别为细胞内酶。根据角蛋白酶反应的最适pH值不同可以把角蛋白酶分成酸性酶和碱性酶二大类;多数角蛋白酶反应的最适温度在45℃~50℃,而念珠菌酸性蛋白酶(CAP)的最适温度为37℃。多数酶的活性表达依赖低浓度二价金属离子(Ca2+、Mg2+等),而一些重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+等)、1,10-邻二氮杂菲和EDTA则抑制其活性[3,4]。不同的角蛋白酶有不同的特异性抑制剂,分别属于不同酶家族的抑制剂,提示角蛋白酶具有不同的进化起源。角蛋白酶的产生需要底物的诱导,如用蛋白胨培养的犬小孢子菌不产生角蛋白酶,但在培养基中加入人发后,则可以产生角蛋白酶。角蛋白酶的底物范围相当广泛,除角蛋白外,还包括多种多肽、胶原蛋白、酪蛋白、弹性蛋白、血红蛋白、明胶和卵蛋白等。但一些角蛋白酶底物范围却较窄,如鸡禽毛癣菌酶只能利用鸟类羽毛,因此,它只感染鸟类。而密旋链霉菌释放的丝氨酸蛋白酶,P1位点对底物的精氨酸和赖氨酸有专一性,而P1'位点对苯丙氨酸和精氨酸有专一性。该酶对底物表现出高度的立体选择性和二级结构专一性[5]。角蛋白酶反应的水解产物因角蛋白酶的不同而不同,须癣毛癣菌角蛋白酶I的水解产物是氨基酸,颗粒发癣菌角蛋白酶则是短肽。

  2 角蛋白酶与免疫
  角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子,是研究真菌疫苗的一个候选抗原,能否利用角蛋白酶作为疫苗来预防动物和人的皮肤真菌感染一直是人们关注的问题,因此,研究角蛋白酶与宿主免疫的相互关系非常重要。Descamps F等[6]认为针对真菌抗原的循环抗体与皮肤真菌感染的易感性及疾病的恢复无明显的关系,与体液免疫不同,细胞免疫反应与皮肤真菌感染的康复及抗病性的获得密切相关,针对真菌抗原的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)与皮损的恢复以及防止复发密切相关,缺乏DTH则与真菌的易感性和慢性感染相关。将真菌感染鼠的Th细胞转移至易感鼠可获得过继免疫,也说明了细胞免疫反应在真菌感染中的重要性。Mignon BR等[7]最早观察了天然的犬小孢子菌外抗原和纯化的重组犬小孢子菌31.5kDa角蛋白酶对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型体液免疫和细胞免疫反应的影响,发现纯化的角蛋白酶并不诱导豚鼠产生抗角蛋白酶IgG,角蛋白酶不引发或仅引发微弱的DTH,提示31.5kDa角蛋白酶不是犬小孢子菌感染的重要抗原。Brouta F等[8]用ELISA法和淋巴细胞增殖分析方法观察了天然的犬小孢子菌外抗原和纯化的重组角蛋白水解金属角蛋白酶(recombinant keratinolytic metalloprotease,r-MEP3)对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型体液免疫和细胞免疫的影响,发现外抗原和r-MEP3均可促进豚鼠的体液免疫和细胞免疫。Woodfolk JA等[9]也发现重组红色毛癣菌角蛋白酶Tri r2激发速发型超敏反应和DTH,认为对真菌特异性抗原的低反应性是造成人类真菌感染的原因。  Descamps F等[10]用纯化的重组犬小孢子菌31.5 kDa角蛋白酶和天然的犬小孢子菌外抗原作为疫苗免疫豚鼠,并观察其对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型的作用。结果发现角蛋白酶和外抗原均可引起强烈的体液免疫和细胞免疫反应,但反映皮损严重程度的评分与对照组之间无显著差异。说明犬小孢子菌31.5kDa角蛋白酶诱导的特异性免疫反应不能对犬小孢子菌的感染起保护作用。因此,在利用角蛋白酶研制真菌疫苗的道路上仍然面临着诸多困难。

  3 角蛋白酶与皮肤病的治疗
  角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子,因此,能否利用角蛋白酶抑制剂或者角蛋白酶单克隆抗体抑制角蛋白酶的作用,削弱皮肤真菌的侵袭性,从而达到治疗皮肤真菌感染的目的,是今后研究角蛋白酶与皮肤真菌感染相互关系的一个重要方向[11]。迄今为止,尚缺乏研制角蛋白酶单克隆抗体在体表中和角蛋白酶削弱皮肤真菌的侵袭性报道。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性,利用角蛋白酶改善药物在角蛋白中的通透性,提高皮肤外用药物的疗效,特别是在银屑病、角化过度性皮肤病(神经性皮炎、慢性湿疹等)和甲病中的治疗应用值得研究。角蛋白酶也可以应用于美容护肤品,帮助活性因子透过皮肤屏障,去除皮肤多余角质,实现皮肤的深层护理。角蛋白酶能水解毛发角蛋白,利用角蛋白酶进行脱毛,治疗多毛症也可能具有良好的应用前景。

  4 角蛋白酶与疯牛病
  疯牛病,即牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathies,BSE),1986年首次在英国发现,其病原是一种不同寻常的传染因子,该因子与羊瘙痒病的致病因子十分相似。一般认为由于牛食用了含有病原的反刍动物蛋白饲料而引起。人类海绵状脑病(克雅氏病Creatzfeldt-Jakob disease,CJD),其病原与疯牛病有关。由于Prion蛋白(Prion Protein,Protease resistant Protein,PrP)是唯一可检测到的与本病感染有关的大分子。因此,绝大多数学者认为这两个病都是由PrP引起。该蛋白是一种正常宿主蛋白的异构体,与宿主蛋白相比,对蛋白酶具有较强的抵抗力。PrP分子量为2.7×104~3.0×104道尔顿,是一种以糖蛋白为主体的特殊的致病因子。PrP有二种,一种正常机体内存在的由染色体编码的对蛋白酶敏感的PrPc,这种PrPc在某种尚不清楚的机制作用下产生翻译后的转化,从含有大量α螺旋的构象转化成含大量β折叠的构象,随着立体构象的改变,其化学性质也变成对蛋白酶有抗性的PrP,称为PrPres或PrPsc。PrPsc具有致病性,致病PrPsc与正常PrPc接触可使正常PrPc转化成致病PrPsc。有学者认为是通过逆转录指导的自身复制,但是至今,其具体复制机制尚不明确。Langeveld JP等[12]用地衣芽孢杆菌PWD-1菌株产生的细菌角蛋白酶测试了完全降解疯牛病和羊瘙痒病动物脑干组织中PrPsc 的条件,结果显示只有在大于100℃的热预处理的条件下,才能广泛酶解PrPsc,使之用免疫组化方法无法检测到。其他的枯草杆菌蛋白酶如蛋白酶K和蛋白酶L也同样有效。因此,角蛋白酶可能被应用于医疗和实验仪器的净化;利用角蛋白酶灭活PrPsc,最终实现疯牛病的防治有待于进一步的研究。目前,角蛋白酶已经广泛应用于动物饲料生产、羽毛和皮革类废物生物降解以及皮革工业中的脱毛等方面,角蛋白酶降解PrPsc的作用,将大大地提高角蛋白酶在这些领域中的应用价值[13]。

  5 基因工程角蛋白酶的研究
  以往对角蛋白酶的研究工作主要集中于菌种筛选、酶的提取纯化和活力测定等基础工作,对酶结构和基因表达的研究极少。20世纪90年代,随着分子生物学技术的发展,国外的一些学者开始进行角蛋白酶基因工程表达和分子结构等方面的研究。Lin X等采用随机引物PCR的方法获得了编码地衣芽孢杆菌PWD-1菌株分泌的角蛋白酶基因(Ker A)的全序列,Ker A基因与地衣芽孢杆菌NCIMB6816编码Carlsberg枯草杆菌蛋白酶的基因具有97%的同源序列。将Ker A基因转染产酶缺陷型枯草杆菌DB104菌株,该转化菌株能在含羽毛的培养基和LB培养基中产生活性角蛋白酶[14~16]。Woodfolk JA等从红色毛癣菌cDNA文库克隆了Tri r4,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达了重组蛋白Tri r4,一个含726个氨基酸的蛋白质,属丝氨酸蛋白酶家族。另外,还在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21中表达和发现了Tri r2,一种毛癣菌的新抗原,编码412个氨基酸,属D类枯草杆菌蛋白酶亚家族;通过SYBYL分子模建软件包进行分子模建,明确了Tri r2的三维分子结构和免疫优势T细胞抗原决定簇的分子位点[9,17,18]。2002年,Descamps F等[19]成功地从犬小孢子菌中获得了3个具有角蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶的基因全序列,并通过毕赤酵母系统重组表达了SUB3角蛋白酶[6]。Wang JJ 等[20]用枯草杆菌表达系统和埃希氏大肠杆菌系统表达了角蛋白酶—链亲和素融合蛋白,并用生物素—亲和素一步法纯化了融合蛋白,提高了纯化效率和角蛋白酶的稳定性。上述研究为角蛋白酶的工业化生产与应用提供了良好的工作基础。由于微生物在底物诱导状态下表达角蛋白酶,而在非底物诱导状态下不表达角蛋白酶,因此,差异PCR等方法不失为发现角蛋白酶新基因的良好手段。
  综上所述,角蛋白酶作为皮肤真菌重要的侵袭因子,一方面,在皮肤真菌感染的发病中起重要作用;另一方面,角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性,其在生物医药、美容、废物处理及动物饲料生产等方面具有广阔的应用前景。

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