叶丽娟1,2 王佳珉2
王辂1,2 曹毅1*
(1. 四川大学 生命科学院 四川 成都 610064)
(2. 中国医药集团总公司 四川抗菌素工业研究所 四川 成都 610052)
摘 要: 【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法，用于筛选头孢克洛合成活性提高或
热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生
物在 340 nm 处有特征吸收峰的原理，制作出标准曲线。采用全细胞 96 孔板紫外分光光
度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与
△A340−405在(0.1−0.6)×10−3
mol/L 浓度范围内有良好的线性关系, 服从朗伯-比尔定律, 平
均回收率为 99.8%−101.3%。一轮定点饱和突变产生的 2 300 个克隆经该方法的筛选, 获
得 3 株 kcat提高 40%以上, 4 株半失活温度较野生型提高 5 °C 以上的突变体酶。【结论】该
方法准确可靠，每天筛选量可达到 2 000 个反应, 达到高通量筛选的要求。
关键词: α-氨基酸酯水解酶, 头孢克洛, 紫外分光光度法, 全细胞高通量筛选, 定向进化
