果胶酶的固定化及其活力测定

一、实验目的：

果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。

二、实验原理：

本实验固定化方法为共价结合法。以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。

三、试剂及仪器

仪器：冷冻离心机 分光光光度计 比色皿（8只） 摇床 水浴箱 混合振荡器 天平 瓷盘 药匙 剪刀(1把) 记号笔（1支） 通风橱 吸水纸 具塞刻度试管（4支） 三角瓶（2支） 烧杯（50ml×3个） 试管架（1个）试管（6支） 量筒（50ml×1个）滴管（16个） 离心管(5ml×2个,50ml×1个)移液管架(1个) 移液管(2ml×3个,5ml×1个) 注射器（1支） 滴管(1个)吸耳球（1个） 洗瓶（1个） 玻棒（1个）烧杯(300 ml×5个)

试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0） 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5－二硝基水杨酸 氢氧化钠 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 95％乙醇 浓盐酸 果胶酶 果胶 半乳糖醛酸 壳聚糖 蒸馏水若干桶

四、方法步骤

1 载体的制备

1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。

1.2配制40ml 10%的NaOH溶液,均分到三个小烧杯中。用注射器吸取约3ml壳聚糖的溶液滴入10%的NaOH溶液中，即得到壳聚糖的微珠。静置10min，蒸馏水浸洗至中性，最后用pH7.0的磷酸缓冲液浸洗一次（3min）。

1.3倾去磷酸缓冲液。

2 载体的活化

三份载体中各加入4%的戊二醛溶液约20ml，过夜或室温活化5h，中间摇动。

3 偶联

3.1取果胶酶0.1g，加入18ml水、2ml乙酸－乙酸钠缓冲液，摇床上振荡5h，8000rpm离心10min，上清液即初始酶液，留2ml酶液置于一支干净的5ml离心管中4℃备用

3.2水洗除去游离戊二醛（5min×5次）。

3.3将活化的载体合并，用所剩酶液覆盖载体，4℃过夜。

4 活性的检测

4.1水洗除去游离酶（2min×4次），回收在小三角瓶中的滤液即残余酶液置于4℃备用。收集小球，滤纸吸干，4℃备用。

4.2按下表所述步骤加样，进行固定化酶的酶活测定(20粒固定化酶颗粒称重)：

4.3游离酶的酶活测定