⑷ 洗脱、收集、鉴定
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。
当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。
同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。
用pH7.8，2.5mmol／L(100mL)一200mmol／L(100mL)的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱。流速1mL／min，每管收集3mL。测定洗脱液的蛋白质含量和酶活，并绘制曲线（用紫外分光光度计测各管的 OD 280 ， OD 280 数值高的管进行酶活测定 ）。
⑹ 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生
许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。
2、植物组织SOD活性测定：超氧化物歧化酶活性测定的方法有多种，其中以化学法应用O·最为普遍。化学测定法包括两个方面：一方面是产生超氧自由基，
如黄嘌呤氧化酶起作用时会产生O，肾上腺素自氧化和邻苯三酚在碱性条件下自
氧化都会产生O .；另一方面是对O·的检测，多数是利用反应液中能与O·起作用，并易于被检测的指示物质的浓度变化来测定SOD活性。常用的方法有：黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法，邻苯三酚自氧化法，超氧化钾直接滴定法，氯化硝基氮蓝四唑-核黄素法。
可采用氮蓝四唑(NBT)光还原法。在该反应系统中，核黄素照光产生02-，NBT在光照下被02-还原为蓝甲月替，产物在560nm下有吸收峰。通过测定加入酶液后蓝甲月替含量的变化，可计算出SOD的活性。
3、分析方法
蛋白质含量测定：采用紫外线吸收法。
酶纯度用比活力表示。比活力=酶活/蛋白质含量。
三、设备
高速组织捣拌机、电热鼓风干燥箱、LD4-40离心机、酸度计、恒温水浴锅、天平、冷冻离心机、可见分光光度计、微量进样器、自动部分收集器、TH-梯度混合器、HL-IS恒流泵、紫外可见分光光度计、层析柱、光照箱
四、材料、试剂
1、圆葱
2、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、、无水碳酸钠、NaOH、CuSO4、酒石酸钠钾、钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）磷酸溶液、浓盐酸。硫酸锂、液体溴、NaOH标准溶液、酚酞、标准牛血清蛋白、Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O氯化硝基氮蓝四唑、乙二胺四乙酸二钠、 核黄素、dl-甲硫氨酸、丙酮（0.5%）0.5mmol/L NaCl、1mol／L HCl溶液、1mol／L NaOH溶液
3、溶剂配制
⑴50mmol/L PBS溶液(pH=7.8): ①取17.9070gNa2HPO4.12H2O定容至1000ml; ②取1.9501gNaH2PO4.2H2O定容至250ml.用②滴定①pH至=7.8,即为50mmol/L磷酸缓冲溶液.
⑵2.25mmol/L NBT溶液:取0.1840g氯化硝基氮蓝四唑用pH为7.8的50mmol/L PBS溶液定容至100ml.
⑶ 0.003mmol/L EDTA:取0.0011g乙二胺四乙酸二钠用pH为7.8的50mmol/L PBS溶液定容至1000ml.
⑷60mmol/L 核黄素:取0.0023g核黄素用pH为7.8的50mmol/L PBS溶液定容至100ml.
⑸14.5mmol/L dl-甲硫氨酸:取0.2163gdl-甲硫氨酸用水定容至100ml.
⑹1mg/ml标准牛血清蛋白:准确称取0.05g牛血清蛋白定容至50ml。
⑺pH7.8，2.0mmol／L的磷酸钠缓冲液：
A液：2.0mmol／L磷酸钠（NaH2PO4.H2O 0.287g定容至1000ml）
B液：2.0mmol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 0.711g定容至1000ml)
按表1方法配制不同pH值缓冲溶液，取A液x ml和B液y ml，稀释成200ml溶液备用。
表1 不同pH值缓冲溶液配制
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pH
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X ml
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Y ml
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|
7.8
|
8.5
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91.5
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⑻pH7.8，200mmol／L的磷酸钠缓冲液：
A液：0.2mol／L磷酸钠（NaH2PO4.H2O 28.70g定容至1000ml）
B液：0.2mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 71.1g定容至1000ml)
按表1方法配制不同pH值缓冲溶液，取A液xml和B液yml，稀释成200ml溶液备用。
表2不同pH值缓冲溶液配制
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pH
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X ml
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Yml
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7.8
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8.5
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91.5
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