五、实验步骤
（一）酶的制备
1、粗酶液的提取
将圆葱切至3cm左右见方的小块,放入高速组织捣拌机中,捣碎3-5分钟,以0.5倍的0.5mmol/LNaCl于4℃下浸泡过夜。然后5000转/分钟冷冻离心，20分钟,弃去沉淀,留取上清液,即为SOD抽提液.留样5ml测定其酶活和蛋白质含量。注意：冷冻离心瓶相对位置应配平。
2、热变性
将粗酶液在55℃下进行处理30分钟，然后高速冷冻离心，5000转/分钟,20分钟,弃去沉淀,留取上清液，留样5ml测定其酶活和蛋白质含量。
3、丙酮分级沉淀
取经热击处理后的上清液，缓慢加入冷丙酮量为0.4V/V，然后在冰浴条件下搅拌，冰浴2小时。5000转/分钟高速冷冻离心，20分钟，弃去上清夜，沉淀用5倍2.5mmol/L的磷酸缓冲溶液溶解，留样2ml测定其酶活和蛋白质含量。（此时去除杂蛋白的效果最好。）
4、DEAE-纤维素柱层析
取经过丙酮沉淀后溶解的上清夜，稀释10倍，过DEAE-纤维素柱（2.6mm*40mm）。先用2.5mmol/LpH7.8磷酸缓冲溶液平衡3-4个床体积,上样量为1毫升，继续用2.5mmol/LPH7.8磷酸缓冲溶液冲洗120ml,然后再分别用2.5-250mmol/L, pH为7.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，流速为0.6 ml/min，每5分钟收集一管。紫外监测波长280nm，然后收集有活性的部分，量取体积，测定蛋白质含量和酶活性。留取少量溶液备用。
（二） 酶活性的测定
2.1活性的测定
测定前在54ml14.5mmol/Ldl-甲硫氨酸中分别加入EDTA,NBT,核黄素溶液各2ml混匀，此为反应混合液。
在盛有3ml反应混合液的试管中，加入适量的酶液（以使抑制达50%左右的酶浓度为佳），混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光30分钟，迅速测定560nm下的光密度，以不加酶液的照光管为对照，计算反应被抑制的百分比。或者按照表1加入试剂量进行添加。
表1
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试剂
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样管
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最大光化管
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对照管/ml
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dl-甲硫氨酸
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2.7
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2.7
|
2.7
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EDTA
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0.1
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0.1
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0.1
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核黄素
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0.1
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0.1
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0.1
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NBT
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0.1
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0.1
|
0.1
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酶液
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适量
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---
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---
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2.2活力的计算
以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活单位。其SOD活力可由下式计算
SOD活力（U/ml）=×100%=
（三） 蛋白质浓度测定——紫外线吸收法
3．1制备法标准曲线
按照下表分别在以下8个比色管中加入标准蛋白溶液、蒸馏水、不同蛋白质浓度的样品后，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的吸光值A280值，以A280 值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。取16支试管，分两组按下表平行操作。
表2
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1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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8
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标准蛋白溶液/ml
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0
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0.5
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1.0
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1.5
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2.0
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2.5
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3.0
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4.0
|
|
蒸馏水/ml
|
4.0
|
3.5
|
3.0
|
2.5
|
2.0
|
1.5
|
1.0
|
0
|
|
蛋白质浓度（mg/ml）
|
0
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0.15
|
0.25
|
0.375
|
0.5
|
0.625
|
0.75
|
1.0
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A280
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3．2样品蛋白质浓度测定
取待测蛋白质溶液1ml，加入3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。如果样液被稀释，则未知蛋白浓度按下列公式计算
蛋白质(g)/ml酶液=
六、结果
总活力和收率按下列公式计算，将结果添于表3。
总活力（U）= SOD活力×原液总体积
收率= ×100%
表3--SOD的分离纯化结果表
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酶液体积（ml）
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蛋白浓度(mg/m)
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单位活力(U/ml)
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总蛋白（mg)
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总活力(U)
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比活力(U /mg)
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活性回收（%）
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纯化倍数
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粗酶液
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热击
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丙酮沉淀
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DEAE层析
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七、思考题
1、超氧化物歧化酶对人体有何生理学意义？
2、有机溶剂能沉淀超氧化物歧化酶所根据的原理是什么？
3、离子交换纤维素有何特点？为什么人们常用它来分离纯化酶及其他生物活性大分子物质？
4、何为梯度洗脱法？它有何特点？
