1.4 分析方法：测定漆酶酶活方法
测定漆酶酶活有以下5种方法，我们选用第一种方法来测定酶活。
1.4.1 ABTS ——分光光度计法
以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点： (1) ABTS 易溶于水，在室温下放置6 个月仍较稳定。 (2) 其反应只有一步，即从ABTS 到它的阳离子自由基。ABTS 的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。 (3) 在漆酶的作用下，ABTS 有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。 (4) 到目前为止，还未有报道称ABTS 有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。
Wolfenden and Wilson 分别对5 mmol/ L ABTS加入20μmol/ L 的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS 呈浅蓝绿色，且在415 nm 处有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415 nm 处无吸收峰。 ABTS 的最大吸收峰在340 nm ，ABTS 的阳离子自由基的最大吸收峰在415 nm. 由此推断，在ABTS 的溶液中含有极少的ABTS 阳离子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS 为底物进行漆酶的定量分析，通常在420 nm 下测定3 min 内吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即ABTS 阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ABTS 浓度的影响。 这就产生了一个问题：420 nm 下的摩尔吸光系数36 000 L/ (mol•cm) 是在纯ABTS 阳离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中，ABTS 是过量的，这就导致人们低估了酶活。 这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1 mmol/ L的ABTS。尽管用ABTS 为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的最佳底物之一。一般以ABTS 为底物，采用Glycine2HCl 缓冲体系、乙酸2乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐2磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对ABTS 的氧化。
1.4.2 丁香醛连氮——分光光度计法
丁香醛连氮( Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为相应的醌，它的摩尔吸光系数为65 000 L/ (mol•cm)。其摩尔吸光系数较大，可见用它定性测定漆酶的酶活具有较高的灵敏度。采用McIlvaine 缓冲体系(pH = 5. 0) ，在525 nm 处测定吸光度的增加。
1.4.3 二茂铁——分光光度计法
以二茂铁(Fe2H)为底物的反应方程式：Fe2H + e2Cu2 + e2Cu + + [ Fe2H] +e2Cu + + 4H+ + O2＝ e2Cu2 + + 2H2O -[ Fe2H] 溶于水，呈蓝色，在617 nm 处出现特征吸收峰，Fe2H 不对其发生干扰。因此，以二茂铁为底物，用分光光度法测定漆酶活性准确度较高，重复性较好。由于二茂铁不溶于水，因此季立才等选亲水性和疏水性都较好的DGBE 作溶剂，与0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液以1∶5 体积比混合后，使二茂铁以一定浓度溶解，同时保持漆酶活性。季立才等从生漆中分离、纯化漆树漆酶，并经CM2Sephadex C50 柱层析，得蓝色酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个组分，以二茂铁为底物，用DGBE2磷酸盐缓冲液(pH = 8. 0) ，在617 nm 处测定吸光度的增加。该方法无副产物干扰，简便、准确、易行。但目前使用并不广泛，故用这种方法测定的酶活力的可比性不高。.还有其它一些用于漆酶酶活测定的底物，无论用哪一种底物进行测定，都有其自身的优势和不足。
1.4.4 微量热法
望天志采用L KB22107 Batch 型微量热系统，在温度为298. 15K，pH = 7. 4 的条件下，测定了漆酶催化氧化底物3 ，4 ，5-三羟基苯甲酸、邻苯三酚、邻甲氧基酚的活性，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制成pH = 7. 4 的缓冲液。 该法操作简单，所用样品量少，不需要光学透明的样品，对酶的悬浮液也能直接测定，对反应体系没有任何限制或干扰。
1.4.5 脉冲激光光声法
阎宏涛等首次采用脉冲激光光声法测定了漆酶酶活。试验了入射激光能量、激光照射时间和温度变化等因素对漆酶活性的影响；建立了测定漆酶的光声分析方法，检测限为3μg ，是一种高灵敏度的生物样品分析方法。
3.3.1 ABTS法测酶活
3.3.1.1 主要试剂与仪器
主要试剂：
⑴ 1 mmol/ L ABTS溶液，ABTS 为美国Sig2ma 公司产品 ，精确称取 0. 0274g AB TS ，用蒸馏水定容至100 mL ，置于棕色瓶备用；
⑵ Hac-NaAc（pH4.5）缓冲溶液，18gNaAc，9.8mlHAc，用蒸馏水定容至1L，用pH计校准其 p H值。
主要仪器：⑴UV - 2100 型紫外 - 可见分光光度计， UNICO 尤尼柯（上海）仪器有限公司；⑵DELTA 320型 pH计，METTLER TOLEDO 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司。
3.3.1.2 漆酶最适 p H 值的测定方法
在 25 ℃时，以 2mLBritton2Robinson 缓冲溶液，外加 1 mL 用蒸馏水稀释 104 倍的漆酶液为空白；先设定参数，使吸光度自动归零。取 1 mL 相应 pH 值的Britton2Robinson 缓冲溶液，用蒸馏水 1 mL 稀释104 倍的漆酶液 ，再加 1 mL 的 1 mmol/ L AB TS 溶液于比色皿启动反应，同时用 UV - 2201 型紫外 - 可见分光光度计的 TIME2COURSE 程序记录吸光度在420 nm 波长处 4 min 内的时间历程 ，取该曲线最初部分的斜率为酶反应的速度，酶反应速度最大时对应的 pH 值为漆酶的最适 pH 值。
查文献知漆酶酶活最适pH为4.5。
3.3.1.3 漆酶稀释倍数及酶活力的测定方法
取酶液0.1ml，加入Hac-NaAc（pH4.5）缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下吸光值。共读取6～7个数值。以经验判断，若吸光值增长迅速，则将酶液稀释2～5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均在0.2～0.8之间。酶活的计算：吸光度变化的斜率×4000×稀释倍数。
