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荧光素酶及其报告基因的应用和检测

   日期:2016-11-16     来源:丁香园    
核心提示:正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强,检出的灵敏度高,没有激发光的非特异性干扰,信噪比较高,具有其他报告基因不可替代的优势,它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具, 在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法,对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。
 一  生物发光

  生物发光(bioluminescence)

是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收,而是一种特殊类型的化学发光,

化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是:由细胞合成的化学物质,在一种特殊酶的作用下,使化学能转化为光能。

  与荧光的区别在于:  荧光:荧光检测需要激发光源,发射光的能量来源于激发光,荧光反应为瞬时反应。 发光:生物发光、化学发光,发光反应无需激发光源,发射光的能量来源于化学反应,发光有一定的持续时间。

二  荧光素酶 

荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。  自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白,是一个61kDa的单体酶,无需表达后修饰,直接具有完全酶活。  

发光机制  

    生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550~580 nm 的荧光,其化学反应式如下。  这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三  荧光素酶报告基因  

报告基因(report gene)是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因,可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。

1  常见的报告基因:  

β‐半乳糖苷酶(β‐Gal)

葡萄糖醛酸酶(GUS)

绿色荧光蛋白(GFP)

分泌型碱性磷酸酶(SEAP)

荧光素酶(LUC)

三  荧光素酶报告基因  

2  报告基因简单实验流程  l

构建包含有报告基因的质粒 l

将构建好的质粒转染细胞 l

提供相应的刺激(诱导) l

检测报告基因 l

数据分析

 3  荧光素酶作为报告基因的优势:  ²

内源性低,哺乳动物无内源性表达 ²

荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 ²

发光检测,检测方便  ²

灵敏度高,10‐20摩尔荧光素酶分子 ²

检测范围广,大于7个数量级

3  荧光素酶作为报告基因的优势:  ²

内源性低,哺乳动物无内源性表达 ²

荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 ²

发光检测,检测方便  ²

灵敏度高,10‐20摩尔荧光素酶分子 ²

检测范围广,大于7个数量级 4  

其它报告基因

 

 

 

正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强,检出的灵敏度高,没有激发光的非特异性干扰,信噪比较高,具有其他报告基因不可替代的优势,它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具, 在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法,对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。

四  荧光素酶报告基因的检测方法  

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillationcounter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。  

五  利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光  

1 打开MicroChemi相机开始制冷  

2将植物叶片喷加发光底物(喷底物的过程需遮光)  

3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育10min(孵育时间随样品而定)

4 打开MicroChemi软件,设置拍摄参数  

5利用binning3x3,每10分钟曝光一次,共曝光三张

6添加伪彩,调节照片的对比度,得到最佳照片

附:利用MicroChemi2.0检测烟草叶片中荧光素酶的发光,曝光10min,binning3x3

 

 

 
标签: 荧光素酶
 
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