关键词：单宁酶；黑曲霉（Aspergillus）；植物多酚；可水解单宁；没食子酸（GA）
1. 引言
起源于我国古老酿酒工艺在可发酵中草药产品加工中的实际应用，传统上称为“炮制”，现代生药学概念就是酶解辅助提取。这在民间民族医药学中积累了丰富的经验，它对中草医药学用于疾病的预防和治疗起到了良好的作用。典型的中药品种如红曲,六神曲，半夏曲等，它们都是经过微生物的自然发酵加工而成。2010年版的《中国药典》收载的含发酵类中药的中成药制剂有百余种之多，加上部颁标准和各地方标准收载的种类则更多。
在我国现有的中药资源统计有12807种中，药用植物占有11146种，资源型占比近九成。过去40多年来，伴随着植物化学的研究进展，特别是集中在对植物多酚（plant polyphenols），又称植物单宁，或称鞣质的天然产物化学研究表明，以单宁为主体的植物多酚对微生物具有广谱抗性，对丝状真菌，酵母，细菌及病毒均都呈现抑制效应。它们的生物活性成分主要功能包括止血，抗氧化，抗病毒，促进氮代谢，改善肾功能，以及精神疾病治疗，故称谓植物多酚为天然有机化合物的新家族。
显然，随着中药现代化的发展，研究可发酵中药炮制加工过程中，除了物理化学手段外，探索应用微生物学及生物化学手段同植物多酚这类天然产物的相互作用，可能导致基于生物转化反应的对植物多酚多样性化学结构修饰作用，从而可能建立起微生物酶法加工的现代中药生物制造工艺。
植物单宁通常分为可水解单宁（hydrolyzable tannins）和缩合单宁（condensed tannins）。真菌单宁酶（tannase，EC 3.1.1.20）作为一类酰基水解酶较易同前者触发酶促反应，其用途广泛。日本在单宁酶的R&D方面一直领先，已经在茶业饮料加工中已经取得了较好的经济效益；国内仅有零星研究，尚存在不小差距。本文重点介绍本实验室于90年代初，经由国家自然科学基金资助开始，定向筛选丝状真菌单宁酶对我国独特生物资源五倍子及滇橄榄果可水解单宁的生物转化应用基础实验研究，以及生物制造的应用研究进展。
2. 微生物单宁酶酶法转化的原理及方法
2.1 单宁酶产生菌的分离及诱变选育
目前,分离选育高单宁酶活性的微生物主要来自丝状真菌曲霉属（Aspergillus）的菌种。植物单宁虽然对微生物通常具有抑制生长的能力，但是作为一类植物源性可再生天然产物物质，其生物学特性决定了也具有一定的可生物降解性能。这就为从天然源分离筛选具有单宁酶活性的野生型菌株提供了可能，结合常规的理化诱变技术选育出高活性单宁酶菌株是可行的，加上利用五倍子高含量可水解单宁（65%），滇橄榄（Phyllanthus emblica，又名余甘子）果也富含45-55%（水提取物干基样品，皮粉法测定）植物单宁物质，借助其与菌株的驯化诱导培养，结合优化的生物催化剂生长培养方法，完成生物酶法转化单宁底物生成GA产物是可行的生物制造技术。
作者实验室长期以来持续不断分离选育符合食品工业加工过程要求安全规范（GRAS）的黑曲霉（Aspergillus niger）CIBCAS系列菌株；同时也借助富集培养技术分离了具有单宁酶活性（塔拉单宁）的青霉菌（penicillium sp.）野生型菌株，为诱变选育高单宁酶活性菌株奠定基础。除了完成前述倍单宁酶法转化制GA外，还对滇橄榄果汁借助固体培养黑曲霉单宁酶酶曲制剂进行酶法加工处理，较好地解决了攀枝花市宇森酒业公司滇橄榄果汁（酒）“去沉淀”难题。
2.2酶法水解倍单宁制没食子酸
已经知道，植物可水解单宁物质在水相介质体系存在酸碱加热或生物催化剂——单宁酶适度保温条件下易水解为酚酸，糖或多元醇酸。典型例证如真菌单宁酶（EC 3.1.1.20）可在温和生理水相介质条件下直接酶法水解五倍子单宁酸（分子量近2000）底物的缩酚酸键，酯键，积累起具有高度商业开发价值的优势小分子产物没食子酸（gallic acid，GA; C7H6O5-H2O=188.14），生物转化反应介质中GA浓度达到40-60g/L。已经完成从实验室的克量制备到500L发酵罐规模的GA公斤级试制生产。这一阶段性生物酶法加工倍单宁生产GA的成果，有希望替代我国传统林产化工酸碱水解工艺生产GA固有的高耗能，资源利用率低，以及环境保护困难的传统旧工艺，建立起生物制造绿色新工艺。
在此基础上，继续完善此工业生物技术存在着2种可供选择的方法，其一是直接利用活性菌丝的发酵法；其二则是借助选育高活性丝状真菌胞外分泌型单宁酶产生菌生产酶制剂，制成固定化生物催化剂进行高效酶法生产。
2.2 黑曲霉单宁酶在中药发酵产品采用“酶解辅助提取”工艺的可行性
如前所述，在筛选出高产酶（酶活/酶量）微生物菌种基础上，借助传统的工业微生物发酵工艺技术，对富含植物单宁的中草药品种进行酶法加工处理，可以达到定向富集有效药用组份，去除无用或有害杂质部分，这对提高中药质量具有重要意义。所以，这在现代工业用酶品种占比75%都是水解酶类的今天，科学合理整合“酶解辅助提取”工艺，发展现代中药显然是可行的。下面以黑曲霉单宁酶用于提高余甘子鲜果酶法加工提高成品中GA含量的可行性进行论证。
2.3．1 余甘子鲜果酶法加工的植物化学基础
经测定余甘子（滇橄榄）果实中含有的单宁成份达45-55%；植物化学研究表明主要为柯子酸，柯黎勒酸，鞣云实素，原柯子酸，柯子裂酸，GA，鞣花酸等。其中的低分子量可水解单宁（<1000）组份称为Embilicanin-A和Embilicanin-B，以及伴同组份Pedunculagin和Punigluconin组份一起，构成了余甘子果借助单宁酶酶法加工，提升GA含量的可作用酶解底物生成GA的基本生物化学原料。同时，这些组份也成为了当今开发余甘子作为美白护肤化妆品有效部位规范提取物的关键化学组分。
2.3.2生物反应器选择
基于上述的理论分析，可以合理设想：借助固体培养制酶曲，应用此生物催化剂在合适的生物反应器中同余甘子鲜果一起保温，适度通气搅拌，适时取样分析（借助TLC和HPLC灵敏可靠的分析手段），监测反应过程，标绘出GA浓度的时程曲线，适时终止反应过程，收获余甘子果进行后加工处理的工艺过程。
当然，这一酶法加工过程的工艺技术须得经过酶解过程的反应参数优化，在获得稳定可重现性结果的基础上，经由制备规模的逐级放大实验研究，进行技术-经济性评估，最后建立起技术成熟度较高的提高余甘子果GA含量的酶法加工生物制造技术体系。本质上，它就是单宁酶酶法转化余甘子果中的可水解单宁底物生成GA的生化过程。
3. 结语
黑曲霉单宁酶作为生物催化剂实现对植物多酚，特别是对可水解单宁类的代表性物质——五倍子单宁酸的酶法水解生产GA技术途径的成功建立，以及实现对滇橄榄果汁的酶法澄清应用研究，都为中药的可发酵产品发展“酶解辅助提取”提供了可参考的范例。
通过从天然源借助定向富集培养技术分离选育出具有单宁酶活性的野生型菌株，结合传统有效的理性化诱变选育技术，可较易于达到工业微生物酶法转化实用化的程度，且为后续的丝状真菌单宁酶分子细胞改造奠定基础。
可以预期，以单宁酶实现对中药可发酵产品的酶法加工过程，必将对提高现代中药产品质量，即富集提高有用药效学组份，降低无用或有害杂质含量具有重要意义。
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