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纤维素酶(CMC)活性检验方法

   日期:2013-02-03     来源:酶制剂网    
核心提示:1 原理纤维素酶在一定的温度和pH条件下,水解羧甲基纤维素钠释放出还原性糖(以葡萄糖计)。在碱性、煮沸条件下,能与3,5二硝基
1 原理
纤维素酶在一定的温度和pH条件下,水解羧甲基纤维素钠释放出还原性糖(以葡萄糖计)。在碱性、煮沸条件下,能与3,5二硝基水杨酸起显色反应,其颜色的深浅与还原糖的含量成正比。在550nm下测定其吸光度,可以计算出还原糖的量,从而得出纤维素酶的活力。
2 活性单位
1g固体酶粉(1 ml液体酶)在50℃±0.5℃ PH5.0条件下,每分钟水解底物产生1μg葡萄糖所需酶液的量定义为一个CMC酶活性单位。
3 仪器与设备
3.1 分光光度计(应符合GB9721的有关规定)
3.2 恒温水浴锅
3.3 电热鼓风干燥箱
3.4 分析天平(感量0.1mg)
3.5 电冰箱
3.6 酸度计(精度±0.01pH)
3.7 定时钟或秒表
4 试剂和溶液(若未特别说明均为分析纯:所用水为蒸馏水或去离子水)
4.1 醋酸-醋酸钠缓冲液(PH=5.0)
甲液:量去冰醋酸6ml,用水定容至1000ml,配成0.1M醋酸溶液。
乙液:称去8.2g醋酸钠,用水定容至1000ml,配成0.1M醋酸钠溶液。
应用液:取甲液三份,乙液七份混合,用PH计矫正至PH为5.0±0.05低温冷藏备用。
4.2 3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)
甲液:取酒石酸钠182g,溶于500 ml水中,再称取重蒸苯酚5 g、无水亚硫酸钠5 g溶于其中。
乙液:取氢氧化钠20.8 g溶于260 ml水中,再加入3,5二硝基水杨酸6 g。
将甲液和乙液倒入棕色试剂瓶混合,再加入240 ml水暗处放一周后使用。
4.3 1%(W/V)羧甲基纤维素钠溶液
准确称取1.0000g羧甲基纤维素钠溶于100 ml PH=5.0醋酸-醋酸钠缓冲液中配制成1%羧甲基纤维素钠溶液。
4.4 1%(W/V)葡萄糖标准储备液
葡萄糖在80℃±2℃烘箱中烘至恒重,准确称取1.0000g溶解并定溶于100ml容量瓶中,置于4℃冰箱内备用,备用期为三天,必要时加叠氮化钠防腐。
4.4.1 葡萄糖标准应用液
分别吸取葡萄糖标准储备液,0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml于50ml容量瓶中,用水定溶于刻度。
5 分析步骤
5.1 标准曲线的制作
按表 1规定的量,分别吸取葡萄糖标准应用液、缓冲液和DNS试剂于各管中摇匀,将各管同时置于沸水浴中反应10分钟,取出后用冷水冷却至室温后,定溶于内直径为15mm的15ml刻度试管中摇匀,再用1cm比色杯,在分光光度计550nm波长处测吸光度,以葡萄糖的量为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,三次重复实验的均值获得线性回归方程,线性回归系数(r)应在0.9996以上方可使用(否则重新操作)。每次新配DNS试剂、更换分光光度计或更换分光光度计部件,都应重做标准曲线。
1 葡萄糖标准曲线
管号
葡萄糖标准应用液
醋酸-醋酸钠缓冲液(ml)
DNS试剂(ml)
浓度(mg/ml)
吸取量(ml)
0
0
0.50
1.5
2.0
1
0.4
0.50
1.5
2.0
2
0.8
0.50
1.5
2.0
3
1.2
0.50
1.5
2.0
4
1.6
0.50
1.5
2.0
5
2.0
0.50
1.5
2.0
5.2 样品的测定
5.2.1 待测酶液的置备
称取2g固体酶粉,精确至0.1mg(或用2ml移液管,准确移取2ml液体酶样)用水溶解,准确稀释定溶,(使试样液与空白液的吸光度之差在0.3~0.6范围内)待测。
5.2.2 操作步骤
取4支内直径15mm的15ml的刻度试管,分别加入稀释酶液0.5ml,取其中3支作为测定管,分别加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液,另一支作为空白管加入2mlDNS溶液,共同在50℃±0.5℃水浴30分钟,三支测定管分别加入2mlDNS溶液,空白管加入1.5ml p H 5.0的1%CMC溶液,在沸水浴中反应10分钟,冷却后定溶至15ml,以空白管调零,在分光光度计550nm处测吸光度。
5.2.3 酶活的计算:
酶活= A×n×1000
0. 5×30
式中:
A— 根据吸光度在标准曲线上,查得的还原糖的量(mg)
n— 酶液的稀释倍数
1000— 由mg换算成ug的换算因子
0.5— 参与反应的酶液的量(ml)
30— 酶反应的时间(min)
 
5. 3 允许误差 同一式样两次测试结果绝对差值,不超过算术平均值的10%。
 
标签: 纤维素酶 CMC
 
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