（二）质粒DNA的制备
有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
1.碱变性法质粒提取的原理：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。
在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。
通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
2.碱变性法提取质粒的步骤：
（1）取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；
（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。
（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。
（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。
（5）离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。
（三）质粒载体的改造
⑴去掉不必要的DNA区段。
⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。
⑶加入易于捡出的选择性标记基因。
⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。
⑸改造或增加基因表达的调控序列。
1、质粒pBR322
结构：
（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）
内部有3种限制酶单一识别位点 。
（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）
内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。
（3）DNA复制起点（ori）
pBR322质粒的优点：
（1）具有较小的分子量。
4363bp，2.6×106Da，
（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。
2、pUC质粒载体
1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。
结构：
（1）来自于pBR322的Ori
（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化
（3） LacZ′基因
编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。
（4）MCS区段
是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。
与pBR322相比， pUC质粒载体优点：
（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数
如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝
（2）适用于组织化学法检测重组体
通过a-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。
（3）具有多克隆位点区段（MCS）
可以定向克隆防止载体自我连接。
