（五）限制性核酸内切酶的消化反应
一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。
影响酶活性的因素很多，最重要的有：
⑴ DNA的纯度
⑵ DNA的甲基化程度
⑶ 酶切反应的温度（通常为37℃ ）
⑷ DNA的分子结构
⑸ 核酸内切限制酶的缓冲液
在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。
二、 DNA连接酶及其应用
（一）DNA连接酶的发现
环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。
首个DNA连接酶(ligase)——大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。
1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。
（二） DNA连接酶作用特点
1. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；
2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。
E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。
T 4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。
（三） DNA连接酶的反应条件
影响连接效率的因素有：
1. 温度（通常在4-15℃ ）
2. ATP的浓度(10μM／L - 1mM／L )
3. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）
4. 反应时间（通常连接过夜）
5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1）
（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。
3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。
三、DNA聚合酶及其应用
（一）大肠杆菌DNA聚合酶I
是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：
5′→ 3′聚合酶活性（模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。
大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途
1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针
利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
2.用于DNA连接前的大缺口填充
利用5′--3′的聚合酶活性。
3.用于DNA的序列分析
利用5′--3′的聚合酶活性。
（二）Klenow片段酶
Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。
酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性
⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性
Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：
⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端
⑵标记DNA片段的末端
底物用［α－32P］－dNTPs
⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成
⑷DNA序列的测定
（三）T4 DNA聚合酶
T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，
1.酶催活性：
⑴5′→3′的聚合酶活性
⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。
因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：
如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。
