（三）柯斯质粒载体
1.柯斯质粒载体的特点
柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。
柯斯质粒的大小为4-6kb，
由3部分组成：
A.多克隆位点区
B. 含有cos位点的lDNA区
C. 复制起始位点和抗性标记区
2.柯斯质粒载体的特性
1、具有l噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。
四种常用载体的比较
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质粒
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λ噬菌体
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柯斯质粒
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单链噬菌体
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克隆DNA大片段
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±*
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+
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构建基因组文库
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+
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+
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构建DNA文库
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+
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常规的亚克隆化
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+
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构建新型的DNA结构
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+
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序列分析
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+
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+
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单链探针
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+**
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+
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外源基因在大肠杆菌中的表达
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+
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一、 限制性核酸内切酶及其应用
（一）限制性核酸内切酶的发现
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。
首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。
从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。
（二）限制性核酸内切酶的分类
分为I型、II型和III型。
（三）限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体
字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；
2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；
3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。
（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性
1、识别位点的特异性
每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
2、识别序列的对称性
靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
3、切割位点的规范性
交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。
同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。
同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。
注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
